甘氨酸对硫酸黏杆菌素体外抑菌作用的影响

刘萌萌，高存帅，徐 玉，毕可东

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

黏杆菌素（colistin）又名多黏菌素E（polymyxin E），是多黏芽胞菌（Paenibacilluspolymyxa）产生的一组碱性环状多肽类抗生素［1］。硫酸黏杆菌素对大部分革兰阴性细菌具有强大的杀菌作用，如绿脓杆菌、大肠埃希菌、沙门菌和变形杆菌等，对绿脓杆菌的作用尤为显著，处于生长期和静止期的细菌均能很快被杀死。同时，还能通过破坏内毒素的超微结构中和革兰阴性菌产生的内毒素，颉颃内毒素的致热性［2－3］。甘氨酸是一种中性氨基酸，可通过破坏内毒素的结构，有效降低血浆中肠源性内毒素的水平［4］，同时还可下调肝组织脂多糖结合蛋白mRNA和内毒素受体基因CD14蛋白的表达［5－6］，从而有效减轻肝损伤。

甘氨酸和黏杆菌素联合应用可有效地颉颃内毒素引起的发热，减轻黏杆菌素的毒副反应［7］。但甘氨酸对黏杆菌素抑菌作用的影响未见报道。本试验通过观察甘氨酸和硫酸黏杆菌素联用对大肠埃希菌、绿脓杆菌和沙门菌体外抑菌作用的影响，以期了解甘氨酸对硫酸黏杆菌素是否具有增效作用，从而为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 硫酸黏杆菌素，批号110116，含量23 000IU／mg，广州市某有限公司生产；甘氨酸，批号110414，含量99.9%，天津市某有限公司生产。

1.1.2 菌株来源 试验用菌株：临床分离的猪源性致病性大肠埃希菌、绿脓杆菌和沙门菌各10株，由青岛农业大学药理实验室提供；标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922，购自中国兽医药品监察所，绿脓杆菌ATCC97853，由济南90医院提供；猪沙门菌（C78－51），购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 培养基 M－H 肉汤，营养琼脂，麦康凯琼脂，SS琼脂，十六烷三甲基溴化铵琼脂。

1.1.4 仪器及设备 DRP－9162型电热恒温培养箱，上海森信试验仪器有限公司产品；BCM－100型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；ZDX－351型座式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；SPS6000F电子天平，梅特勒－拖利多称量设备公司产品；单道可调移液器、8道可调移液器，Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 将全部菌株经复苏、培养（大肠埃希菌于麦康凯培养基、沙门菌于SS培养基、绿脓杆菌于十六烷基三甲基溴化铵培养基），重新划线分离后，挑取单菌落2个～3个，接种到3mL～5mL M－H肉汤中，于37℃培养8h～10h。以平板计数法［8］进行细菌计数。

1.2.2 药液制备 甘氨酸和硫酸黏杆菌素分别用无菌蒸馏水及pH6.0的磷酸盐缓冲液溶解后，制成32 768μg／mL和1 638.4μg／mL的储备液，无菌条件下过滤除菌，备用。

1.2.3 单药最低抑菌浓度（MIC）测定方法 采用微量肉汤稀释法［9］，分别测定甘氨酸和硫酸黏杆菌素对33株细菌的单药MIC值，接种菌量为1×105cfu／mL，37℃孵育18h～24h，观察结果。试验时，每个浓度各做3个重复，同时以标准菌ATCC25922、ATCC97853做质量控制。

1.2.4 联合抑菌试验 采用微量肉汤棋盘稀释法［9］，测定甘氨酸和硫酸黏杆菌素对33株细菌的联合 MIC值，以两药对应各菌的 MIC值的4、2、1、1／2、1／4、1／8、1／16倍浓度在96孔细胞培养板上分别按纵列和横列进行联合，接种菌量为1×105cfu／mL，37℃孵育18h～24h，观察结果。

1.2.5 结果判定 以部分抑菌浓度（FIC）指数做为联合药敏试验的判定依据：FIC≤0.5为协同作用，0.5＜FIC≤1为相加作用，1＜FIC≤2为无关作用，FIC＞2为颉颃作用。

2 结果

2.1 大肠埃希菌抑菌试验结果

甘氨酸和硫酸黏杆菌素单用及联合对大肠埃希菌抑菌试验结果见表1。

2.2 绿脓杆菌抑菌试验结果

甘氨酸和硫酸黏杆菌素单用及联合对绿脓杆菌抑菌试验结果见表2。

2.3 沙门菌抑菌试验结果

甘氨酸和硫酸黏杆菌素单用及联合对沙门菌抑菌试验结果见表3。

表1 甘氨酸和硫酸黏杆菌素单用及联合对大肠埃希菌抑菌试验结果Table 1 Inhibition effects of glycine combined with colistin sulphate against E.coli in vitro

表2 甘氨酸和硫酸黏杆菌素单用及联合对绿脓杆菌抑菌试验结果Table 2 Inhibition effects of glycine combined with colistin sulphate against P.aeruginosa in vitro

表3 甘氨酸和硫酸黏杆菌素单用及联合对沙门菌抑菌试验结果Table 3 Inhibition effects of glycine combined with colistin sulphate against Salmonella in vitro

3 讨论

体外抑菌试验的常用方法主要有常量肉汤稀释法、微量肉汤稀释法和琼脂稀释法3种。常量肉汤稀释法准确、可靠，但操作繁琐；琼脂稀释法易发现污染菌，但制备含药琼脂平板费时费力，且测得的MIC值偏低。所以，本试验采用微量肉汤稀释法对3种细菌进行体外抑菌试验，操作简单、重复性好，可以精确测定甘氨酸和硫酸黏杆菌素在不同的浓度比例下的相互作用。

此外，由本研究知，单用硫酸黏杆菌素对大肠埃希菌、绿脓杆菌和沙门菌较敏感，MIC值在0.64 μg／mL～5.12μg／mL之间。单用甘氨酸对各菌的MIC值较高，在2 048μg／mL～8 192μg／mL之间，细菌表现出较强的耐药性。两种药物联用后，其各自的联合MIC值比单药MIC有所降低，均达到了试验菌的半数以上，硫酸黏杆菌素的抗菌活性提高了2倍～4倍，甘氨酸活性提高16倍～512倍，表明甘氨酸对硫酸黏杆菌素具有增效作用。

同时，由表1、表3看出，两种药物联用后主要表现相加作用，沙门菌中相加作用的占63.6%，大肠埃希菌中相加作用的占63.6%，两者最佳用药比例为100∶1。表2中，相加和协同作用各占54.5%和45.5%，说明对于绿脓杆菌两者主要表现协同和相加作用，最佳比例为50∶1。出现此种结果，可能是由于不同细菌对二者联合应用的敏感度不同，才导致FIC指数范围存在差异及二者最佳配伍比例的不同。二者联用或协同或相加，这点在进行药物配方筛选时，应充分加以考虑。

甘氨酸对硫酸黏杆菌素的增效机理目前尚不清楚。细菌的胞浆膜富含磷脂，对胞内的低分子物质（氨基酸、核苷酸、无机盐、嘧啶、嘌呤等）具有选择性屏障作用。这些物质在胞内具有较高的浓度，平均比胞外高出400倍～500倍，因此可保持胞内高渗透压［10］。黏杆菌素中游离的氨基能与细菌胞浆膜的磷脂物质磷脂酰甘油相结合，使细胞膜的表面张力降低，通透性增高，使细胞内的主要成分从胞浆中流出，最终导致细菌生长发生抑制或引起细菌死亡［11］。此外，硫酸黏杆菌素为表面活性剂，含有亲脂和疏脂基团，可吸附在细胞壁上，其结构中的亲脂链烃可插入到细菌胞浆膜中，破坏菌体内的电子链传递及氧化磷酸化过程，从而使细菌死亡［12］。硫酸黏杆菌素单用杀菌效果较低，可能是由于细菌死亡裂解后会产生大量内毒素，导致部分硫酸黏杆菌素与内毒素结合而失去与细菌结合、杀菌的作用。

甘氨酸的分子结构中也含有游离的氨基，可与游离磷酸基团结合。可能由于细菌外有细胞壁阻隔，且甘氨酸不具吸附功能，所以低浓度时不易与细菌胞浆膜接触并结合从而发挥杀菌作用。高浓度时，甘氨酸与细菌紧密接触的几率变大，所以可以有效与胞浆膜结合并杀菌。当两者联用作用于菌液中时，硫酸黏杆菌素会迅速吸附到细菌细胞壁上，并通过其亲脂链烃插入细菌细胞膜中，使其裂解死亡。死亡后释放出的内毒素可以迅速被周围游离的甘氨酸结合，破坏内毒素，从而降低了硫酸黏杆菌素与内毒素结合的几率，以便更好的发挥其杀菌作用。

综上所述，甘氨酸对硫酸黏杆菌素具有增效作用。两者联合用药不仅可以降低临床使用剂量，有助于减少硫酸黏杆菌素的神经毒性和肾毒性，还可以提高两种药物的疗效，在实际应用上有一定价值。但本试验只是体外药敏试验，还需对二者的体内药代动力学及药效学做进一步探讨，为今后在临床应用提供依据。

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