北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

傅彩霞，郑瑞峰，郭 峰，靳兴军，吴惠明，李 佳，陈立本，王玉田

（北京市兽医实验诊断所，北京 100101）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种以高热、出血和高病死率为特征的高度接触性传染病，是严重危害全球养猪业的重要传染病［1］。在我国，虽然猪瘟兔化弱毒疫苗的使用较好地控制了CSF的大规模流行，但目前在我国的大部分地区CSF仍有散发，并且其流行与发病特点发生了很大的变化，以非典型、温和型、母猪繁殖障碍型以及新生仔猪发病、死亡为主［2］，与其他病毒混合感染日趋严重。许多地区都已相应开展了CSFV分子流行病学研究，这些研究对所在地区CSF的防控发挥了一定的作用。而目前，北京地区缺乏近年CSFV感染的详细分子流行病学研究资料，因此，为了解目前北京地区CSFV流行毒株的遗传变异情况以及其与CSFV疫苗株之间的差异，进一步完善、加强CSF的防控，有必要对CSFV流行毒株进行系统的分子流行病学研究分析。CSFV的E2糖蛋白是CSFV最主要的保护性抗原蛋白，存在于感染细胞或病毒粒子表面，相对于其他结构蛋白保守性最低，最易发生变异。编码CSFV E2蛋白的基因参与病毒对细胞的感染过程，与病毒毒力有关，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇［3－4］，许多学者认为CSFV的E2抗原变异有可能是导致该病毒逃脱或抵御免疫保护的主要原因。本研究对2010年从北京部分地区分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区序列进行了测定与分析，旨在通过分子流行病学研究的方法，为了解北京地区CSFV流行毒株的遗传变异规律及制定更为科学合理的防控措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 7株CSFV流行野毒，分别于2010年采自北京市通州区、平谷区、大兴区、房山区的部分猪场，均通过PK－15细胞传代3代，获得细胞毒，经CSFV RT－PCR（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司试剂）检测为阳性，分别命名为BJTZ1.10、BJTZ2.10、BJTZ3.10、BJTZ4.10、BJPG1.10、BJDX1.10和BJFS1.10。

1.1.2 主要试剂 核酸柱式提取试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品；pGEM－T载体、DNA纯化回收试剂盒、质粒提取／纯化试剂盒、BstZⅠ限制性内切酶均为Promega公司产品；其他常规试剂均为分析纯。

1.1.3 引物的设计与合成 引用国际通用且推荐用于CSFV诊断以及序列比较的E2部分基因扩增引物［5］，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。外套引物 扩 增 671bp：P1 5′－AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA－3′，P2 5′－TTYACCACTTCTGTTCTCA－3′；内 套 引 物 扩 增 272bp：P3 5′－TCRWCAACCAAYGAGATAGGG－3′， P4 5′－CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC－3′。

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸的提取 具体操作参照核酸柱式提取试剂盒说明书进行，同时以ddH2O和CSFV疫苗毒为阴、阳性对照。

1.2.2 反转录（cDNA的合成） 将提取的RNA进行反转录，反转录体系（20μL）包含DEPC H2O 3.1μL、5×buffer 4μL、10mmol／L dNTP 0.4μL、RNase抑制剂0.5μL、AMV反转录酶1μL、随机引物1μL、RNA模板10μL，将上述溶液混匀，瞬时离心。42℃作用90min，95℃作用5min。

1.2.3 PCR反应 取2μL RT产物，建立50μL外套PCR体系；同样条件下，以2μL外套产物为模板，建立50μL内套PCR体系。反应体系为：ddH2O 32.5μL，5×buffer 10 μL，10mmol／L dNTP 1μL，20μmol／L各种引物各1μL，反转录产物2μL，TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，将上述溶液瞬时离心，混匀。反应条件为95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min。

1.2.4 DNA片段的回收与纯化 在12g／L的琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，切下目的条带，用DNA纯化／回收试剂盒对DNA片段进行回收纯化，回收纯化产物溶解于50μL无菌去离子水中，置－20℃保存备用。

1.2.5 PCR产物的克隆与基因测序 将回收纯化的PCR产物连接到pGEM－T载体中，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，经Amp、IPTG及X－gal筛选，挑取白色单菌落，过夜振摇培养，用质粒抽提纯化试剂盒提取质粒，经BstZⅠ酶切和PCR鉴定为阳性后，送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.6 序列分析 利用DNAStar分析软件对本研究分离的7株CSFV流行毒株、王琴等［6］分离的1株北京顺义株（BJSY2／96）及GenBank中已发表的CSFV参考毒株的E2基因部分编码序列进行核苷酸、氨基酸同源性比较及遗传进化情况分析。

2 结果

2.1 RT－PCR扩增结果

结果显示，7份样品分别扩增出了1条大小为272bp的条带，与预计结果相符（图1）。

图1 猪瘟病毒E2基因RT－PCR扩增结果Fig.1 The nested RT－PCR results of CSFV E2gene

2.2 重组质粒的PCR鉴定

对重组质粒进行PCR扩增鉴定，均扩增出一条大小为272bp的条带，结果如图2。

图2 重组质粒PCR鉴定结果Fig.2 PCR results of recombinant plasmid

2.3 重组质粒的酶切鉴定

用BstZⅠ对重组质粒进行酶切鉴定，酶切出的2条带与预期的长度一致（图3）。

图3 重组质粒Bst ZⅠ酶切鉴定结果Fig.3 Recombinant plasmid digested with Bst ZⅠ

2.4 重组质粒的DNA序列测定与分析

对鉴定为阳性的重组质粒进行测序，测得插入片段的核苷酸序列全长272bp，应用DNA Star分析软件对本试验分离的7株CSFV流行毒株、王琴等分离的1株北京顺义株（BJSY2／96）及GenBank中已发表的CSFV参考毒株的E2基因部分编码序列进行了核苷酸、氨基酸同源性比较及遗传进化情况分析（图4～图6）。

2.4.1 核苷酸、氨基酸序列分析及同源性比较 本研究分离的7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%，与王琴等分离的1株北京顺义株（BJSY2／96）（GenBank登录号DQ907712）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为82.4%～83.5%、81.3%～83.5%，与 CSFV Shimen 株 （GenBank 登 录 号U72047）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%；与 HCLV 株（Gen－Bank登录号U72048）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%，与14株来自世界不同地区的CSFV参考毒株的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～90.1%和81.3%～93.4%。

图4 猪瘟病毒分离株与参考株E2基因主要抗原区核苷酸序列同源性分析Fig.4 Homology analysis of the nucleotide sequences of E2major gene of CSFV isolate and reference strains

图5 猪瘟病毒分离株与参考株E2基因主要抗原区氨基酸序列同源性分析Fig.5 Homology analysis of the amino acid sequences of E2major gene of CSFV isolate and reference strains

2.4.2 遗传进化关系分析 将本研究分离的7株CSFV流行毒株、王琴等分离的1株北京顺义株（BJSY2／96）及 GenBank中已发表的17株 CSFV参考毒株的E2基因核苷酸相似性分析结果绘制了CSFV遗传进化树。所绘制的遗传进化树分为3个组群，我国的CSFV Shimen株、HCLV株及王琴等分离的1株北京顺义株（BJSY2／96）均属于基因1群，与意大利Brescia株、日本ALD株、GPE株、德国Riems株、美国Weybridge株及法国CAP株属于同一基因群；7株北京地区近期流行的CSFV毒株均属于基因2群，与法国Alfort株、意大利C1W株等毒株属于同一基因群；韩国Korea 88039－1株属于基因3群。

图6 猪瘟病毒遗传进化树Fig.6 Phylogenetic tree of CSFV

3 讨论

应用分子流行病学研究的方法对CSFV特定基因区段核甘酸序列进行分析，在追踪CSFV的传播，了解各地区CSFV的分布特点，监测流行毒株之间的相关性及遗传变异情况，指导临床更为合理地防控疫病方面具有重要意义。目前在CSFV基因组序列中主要选择E2基因、聚合酶基因（NS5B）、5′－UTR作为靶区段对 CSFV 进行基因分型研究，但以E2、NS5B分型更精确［7］。E2基因是CSFV的主要免疫相关基因。E2基因变异较大，尤其是其基因的5′端，与病毒的抗原变异有关。E2基因编码的囊膜糖蛋白在体内可诱导抗CSFV的保护性免疫［3－4］，E2区段集中了CSFV大部分的抗原表位，对此序列进行比较分析，可对CSFV流行毒株精确分型，并从分子水平反映CSFV流行毒株主要抗原表位的变异情况。本研究采用套式RT－PCR的方法对2010年分离并鉴定的7株北京部分地区CSFV流行毒株的E2基因部分区域进行了基因序列测定，应用分子生物学软件，参考CSFV国外经典代表毒株、我国标准强毒株Shimen株、疫苗株HCLV株以及20世纪90年代北京地区流行毒株的序列，进行了同源性比较，绘制了系统进化树，对北京部分地区目前CSFV流行毒株的分子流行病学特点、遗传演化现状进行了揭示，为今后更为有效预防、控制和净化CSF提供技术参考。

本研究所分析的是CSFV E2基因5′端272bp的片段，位置相应于Alfort株的第2 477～2 748位核苷酸。通过对CSFV各毒株E2基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列间的比较分析发现，北京部分地区2010年7株CSFV流行毒株相互之间核苷酸与氨基酸的同源性分别在96.3%、95.6%以上，而与我国标准强毒株Shimen株、HCLV株及20世纪90年代北京分离株BJSY2／96之间核苷酸的同源性仅为81.7%～83.5%、80.6%～81.7%和82.4%～83.5%，氨基酸的同源性也仅为82.4%～84.6%、78.0%～80.2%和81.3%～83.5%。同源性分析结果表明，7株北京地区近期流行的CSFV毒株相互之间的同源性较高，而与Shimen株、HCLV株之间存在一定的差异，与20世纪90年代北京分离株BJSY2／96之间的差异也较大。

国际上将CSFV分为3个基因群（Group）、10个基因亚群（Subgroup）［5］。CSFV 基因1群主要由20世纪80年代以前亚洲和南美洲的分离毒株组成，以Brescia株为代表；基因2群主要由20世纪80年代和90年代欧洲的分离毒株组成，以Alfort株为代表；基因3群由韩国、中国台湾等地的独特毒株构成。涂长春等分析了全国30个省、直辖市、自治区191个CSFV流行株E2基因变异情况，研究结果表明，中国流行毒株分为2个基因群，4个基因亚群，即2.1、2.2、2.3和1.1基因亚群，并未发现基因3群毒株的存在［8］。本研究将7株北京地区近期流行的CSFV毒株与CSFV参考毒株的E2基因部分编码序列进行遗传进化分析后发现，20世纪90年代北京分离株BJSY2／96与我国的CSFV Shimen株、HCLV株归属于基因1群，而7株北京地区近期流行的CSFV毒株均属于基因2群，且均属于2.1亚群，在遗传关系上接近于Italian株，与Shimen株、HCLV株相距较远，说明，目前北京地区CSFV流行野毒株存在多样性和复杂性。

CSFV E2蛋白约由370个氨基酸组成，存在4个独特的抗原结构域A、B、C、D，这4个结构域位于E2蛋白N端第690～866氨基酸残基之间，是E2蛋白的抗原决定区，其中变异较大的区域在第702～742氨基酸残基之间。结构域B、C属于一个结构单元，是E2的主要中和抗原区，位于第690～800氨基酸残基之间［9－10］。本研究分析的目的片段包含E2蛋白N端第702～791氨基酸残基，是结构域B、C的部分片段，也是中和抗体的结合部位。E2蛋白的氨基酸序列中均含有保守的15个半胱氨酸（Cys）残基，N 末端的6个 Cys（693、737、792、818、828、856）通过形成3对二硫键对E2结构的正确折叠及特异抗原决定簇的形成至关重要，其中N端的Cys693和Cys737形成一个推测的二硫键并固定了B区及C区的构型［10］。本研究分析的E2蛋白区域中只包括Cys737，在7株北京CSFV流行野毒株中Cys737位点均未发生变异。Van Rijn等证明在B、C结构域中705、710、713、729和734等位点氨基酸的变异将可能导致流行毒株逃脱与特定单抗的免疫反应［11］。将本研究的7株北京CSFV流行野毒株与HCLV株、Shimen株及20世纪90年代北京分离株BJSY2／96E2蛋白的氨基酸序列进行了对比分析，结果显示，710位点所有毒株均无变化；7株北京CSFV流行野毒株与HCLV株相比，北京株存在18个共同变异的氨基酸位点，其中705、713、729和734位点均发生变异；与Shimen株相比，北京株存在14个共同变异的氨基酸位点，其中713、729和734位点均发生变异；与BJSY2／96株相比，目前的7株北京CSFV流行野毒株存在15个共同变异的氨基酸位点，其中705、713、729和734位点均发生变异。这些主要抗原位点的差异是否会对疫苗的免疫效果造成一定的影响还有待进一步研究。为进一步阐明北京地区CSFV流行毒株的遗传变异情况，本研究还将对不同时期、不同地区的CSFV感染材料进行连续跟踪测定。

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