猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达＊

周向阳，万 婧，廖 迅，朱竹君，陈晓玮，刘菲芬，方维焕

（1.舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316000；2.浙江大学浙江省动物预防医学重点实验室，浙江杭州 310058）

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是严重危害养猪业的传染病之一，具有高传染性和高致病性的特点，给全世界养猪业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病。猪瘟的病原为猪瘟病毒（CSFV），属黄病毒科瘟病毒属成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒［1］。基因组长约12.3kb，可分为3部分，两端分别为5′和3′端非编码区（untranslated region，UTR），中部为编码区，可编码一个由3 898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。此多聚蛋白可被加工形成12种病毒特异性蛋白，其中4种为病毒结构蛋白，8种为非结构蛋白［2］。

结构蛋白E2在CSFV感染过程中起着重要作用，是主要保护性抗原，基于E2的疫苗（如DNA疫苗和病毒载体疫苗）免疫后，不仅可诱导机体产生中和抗体，还能产生特异性的T细胞免疫应答，保护机体免受强毒的攻击［3－5］。因此，E2蛋白是猪瘟免疫和免疫效果监测的理想抗原，无论是在病毒检测还是在疫苗研制上都具有重要作用。

昆虫杆状病毒表达系统是目前比较有效的真核表达系统之一，此系统表达的外源蛋白在细胞内可以进行正确的折叠、二硫键的搭配和翻译后的加工，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致。杆状病毒表达载体经常用来表达具有特定结构功能的糖蛋白，而且在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中相同。本研究旨在利用杆状病毒表达系统表达CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白，并对其活性进行初步鉴定，为研究E2蛋白的功能，免疫原性，筛选抗原表位以及开发新型疫苗等方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和毒株 Sf9昆虫细胞、基因1型猪瘟病毒石门株由浙江大学浙江省动物预防医学重点实验室保存并提供。DH10Bac菌株、转移载体pFast－BacHTA和转染试剂Cellfectin购自Invitrogen公司；细胞培养基TC－100和胎牛血清购自Gibco公司。Sf9昆虫细胞用添加100mL／L胎牛血清的培养基于27℃恒温培养。猪睾丸细胞系ST由浙江大学浙江省动物预防医学重点实验室保存并提供，用含100mL／L胎牛血清的MEM培养。

1.1.2 试剂 UNIQ－10柱式总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；M－MLV反转录酶购自Promega公司；RNA酶抑制剂购自北京鼎国生物技术中心；ExTaq酶、2.5mmol／L dNTP、限制性内切酶、T4连接酶以及pMD－18T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen生物技术公司；FITC标记羊抗兔IgG购自美国KPL公司；抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体2B10由浙江大学浙江省动物预防医学重点实验室制备并提供制备；鼠抗6×His－单克隆抗体、HRP羊抗鼠IgG多克隆抗体为美国GenScript公司产品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 用CSFV石门株感染ST细胞72h后，按照UNIQ－10柱式总RNA提取试剂盒的说明提取总RNA。在1.5mL离心管中分别加入上述总 RNA 9.5μL，4μL 5×RT－缓冲液，0.5μL RNase抑制剂，2μL dNTP，1μL Radom Prime，0.5μL M－MLV 反转录酶，2.5μL DEPC水，42℃孵育1h，90℃作用5min，灭活 M－MLV反转录酶，获得反转录的cDNA。根据CSFV石门株的基因组E2基因序列及供体质粒pFastBacHTA中多克隆位点序列设计引物，分别在基因的5′端引入BamHⅠ酶切位点，3′端引入HindⅢ酶切位点。E2－F 5′－AGGATCCGCGGCTAGCCTGCAAGGAAGAT－3′，E2－R 5′－GCAAGCTTTTAACCAG CGGCGAGTTGTTC－3′引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR克隆上述基因片段。反应体系：cDNA 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U／μL ExTaq酶 0.5 μL，10×PCR buffer 5.0μL，2.5mmol／L dNTP（含 MgCl2）4.0μL，最 后 加H2O至总体积50μL。反应条件为：94℃3min；94℃50s，55℃30s，72 ℃ 1min，30个循环；最后72℃7min，4℃终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测割胶回收。回收的PCR产物克隆到pMD－18T载体，经 PCR鉴定阳性克隆pMD－18TE2质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.2 重组供体质粒的构建 对pMD－18T－E2用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，克隆入预先进行了双酶切的供体质粒pFastBacHTA中，经酶切鉴定后，得到一个重组供体质粒，命名为pFastBacHTAE2。

1.2.3 重组Bacmid的筛选及鉴定 用获得的重组供体质粒pFastBacHTA－E2转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞，37℃培养4h后，通过含100g／mL X－gal、40g／mL IPTG、7g／mL 庆大霉素、50g／mL卡那霉素和10g／mL四环素的LB平板进行蓝白斑筛选，次日挑取白斑培养于LB液体培养基（含有7g／mL庆大霉素、50g／mL卡那霉素和10g／mL四环素），37℃震荡培养过夜，用碱裂解法小量提取重组Bacmid，用M13通用引物对提取的重组质粒进行PCR鉴定。

1.2.4 重组病毒的获得 参照Lipofectin产品说明书将鉴定为重组的Bacmid转染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃培养120h后，收获重组病毒，用细胞刮刮取细胞，5 000r／min离心5min，将含有重组病毒的上清4℃临时保存或在－80℃长期储存备用。将第1代重组病毒在Sf9细胞上传3代，得到高滴度的重组病毒。

1.2.5 Western blot分析 将病毒感染的Sf9细胞用50μL蒸馏水悬浮，然后与5×SDS样品缓冲液等体积混合，100℃水浴煮5min～8min，冰上放置2min。在4℃以14 000r／min离心5min，进行120g／L SDSPAGE后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，进行Western blot分析。分别使用抗E2蛋白的单抗2B10和6×His－单克隆抗体作为一抗，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，最后ECL化学发光显色。

1.2.6 间接免疫荧光 用重组病毒感染Sf9细胞96 h后，弃去细胞培养液，PBS洗涤3次，用预冷的800 mL／L丙酮－20℃固定15min。弃去固定液，PBS洗涤3次，自然干燥后加入抗E2蛋白的单抗2B10，置37℃培养箱作用2h；PBS洗涤5次，再加入FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃作用1h；最后PBS洗涤5次，500mL／L磷酸甘油封底，荧光显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 CSFV石门株E2囊膜糖蛋白基因的克隆

以反转录后的cDNA为模板，PCR扩增出约1.1kb的片段，与预期大小一致（图1）。将目的条带割胶回收克隆到pMD－18T载体，测序结果表明成功亚克隆了CSFV石门株E2囊膜糖蛋白的基因。

M.DNA标准DL 5 000；1.E2基因M.DNA Marker DL 5 000；1.E2gene

图1 E2基因的PCR扩增Fig.1PCR amplification of the E2gene

2.2 重组质粒和重组Bacmid的获得

将目的基因亚克隆到供体质粒pFastBacHTA中，经BamHI和HindⅢ进行双酶切鉴定，获得重组供体质粒pFastBacHTA－E2（图2）。从白色菌斑中抽提Bacmid DNA，以 M13－F、R引物进行PCR鉴定，获得3.5kb左右的片段，而用蓝斑提取的DNA作为模板，PCR产物为300bp，证实含目的基因的Bacmid构建成功（图3）。

图2 重组质粒的酶切鉴定Fig.2Identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion

图3 重组Bacmid的PCR鉴定Fig.3PCR analysis of recombinant Bacmid

2.3 重组病毒的获得

重组的Bacmid转染Sf9昆虫细胞120h后，转染细胞发生明显的病变，与正常细胞相比，感染细胞的直径变大、形状变圆，细胞核增大，继而离壁漂浮、脱落。连续传3代后病变明显增强，病变出现时间缩短，即获得高滴度的重组病毒。

2.4 表达蛋白的Western blot分析

用重组病毒感染Sf9细胞96h后，收集感染的细胞，进行SDS－PAGE电泳检测和Western blot分析。分别使用抗E2蛋白的单抗和6×His－单克隆抗体作为一抗，HRP标记的鼠抗兔IgG抗体作为二抗，在43ku处可以看到清晰的特异性条带，与预测的蛋白的分子质量大小一致，表明E2蛋白在Sf9细胞中成功表达（图4）。

图4 E2囊膜糖蛋白在Sf9细胞中表达的Western blot分析Fig.4Western blot analysis of E2protein in Sf9cells

2.5 E2表达蛋白的间接免疫荧光分析

用重组病毒感染Sf9细胞96h后，分别用抗E2蛋白的单抗2B10和6×His－单克隆抗体为一抗，FITC标记的羊抗鼠抗体为二抗，于荧光显微镜下观察到Sf9细胞发出绿色荧光（图5）。

3 讨论

杆状病毒载体结合昆虫细胞系可以生产高水平的重组蛋白，与原核表达系统相比，产生的重组蛋白经过了翻译后加工修饰，而且其宿主范围窄（仅限于昆虫），因而对脊椎动物而言具有较好的生物安全性［6］。另外，杆状病毒表达系统应用的昆虫细胞系来源于鳞翅目昆虫，培养相对容易不需要二氧化碳培养箱，可以在无血清培养基中生长而且可以很容易地扩大规模［7］。此外，该系统表达产物带有6个His组氨酸标签，有利于重组蛋白的纯化。杆状病毒表达系统表达生产的外源蛋白能够用于蛋白功能研究、疫苗制备或诊断。

由于囊膜糖蛋白E2在CSFV感染过程中的重要作用，使其成为了近年来研究的热点。部分或者完全缺失E2基因的病毒没有感染性［8］。由于E2蛋白是CSFV的主要保护性抗原蛋白，具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生中和抗体，保护动物免受强毒的攻击［9］，因此，在病毒检测和疫苗研制方面具有重要应用。目前在疫苗生产中主要使用原代牛睾丸细胞进行病毒增殖，但有时会出现病毒毒价不稳定，甚至检测不到子代病毒等问题。随着分子生物学的发展，国内外学者将猪瘟疫苗的研究集中到亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒载体疫苗上。通过杆状病毒表达系统生产的第一个被批准的商品化疫苗就是猪瘟疫苗［10－11］。本研究表达了CSFV石门强毒株的E2蛋白，可以比较强弱毒株间E2蛋白的免疫原性，有待进一步验证。而且E2囊膜糖蛋白内部有1个在CSFV各毒株间高度保守的抗原表位，即829到837位的TAVSPTTLR（结合单抗为WH303），而此表位在BVDV和BDV毒株间却非常易变，因此具有一定的诊断价值［12］。目前的研究已经证明，E2蛋白与CSFV的毒力有关，通过DNA分子重组和反向遗传学技术，置换强弱毒株的E2，结果表明病毒的毒力明显减弱［13］，利用真核系统表达具有天然状态的E2蛋白，对其进行结构功能分析可能会有助于解答E2蛋白如何影响强弱毒株的毒力。CSFV感染细胞的第1个关键步骤是病毒与细胞表面的受体结合，在病毒受体的介导下使病毒颗粒进入细胞内进行复制和繁殖。E2蛋白在病毒吸附进入靶细胞方面也发挥了重要作用，所以在E2的基础上筛选出CSFV的配体结合表位以及与细胞结合的受体，对研制CSFV的新型多肽药物和多肽疫苗具有重要意义［14］。

本研究利用杆状病毒表达系统，构建含有CSFV石门株结构蛋白E2蛋白编码基因的重组病毒，将重组Bacmid DNA转染Sf9细胞，实现了E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达，为深入研究CSFV病毒结构蛋白E2的功能以及研制病毒的新型疫苗奠定了基础。在Sf9培养细胞内表达的E2囊膜糖蛋白的纯化和免疫保护作用的研究有待进一步开展。

图5 间接免疫荧光分析E2蛋白的表达Fig.5Analysis of the E2protein by IFA

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