砂仁中总黄酮的提取工艺研究

王文杰，史 欢，黄国旺，史 航，谢 亮，郭豫梅

(陕西理工学院 化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001)

砂仁 (amomum fruit)是一种多年生草本植物，生长于山谷林下、阴湿地，其果实是常见的中药，可行气和中、开胃消食、养脾止泻、理气安胎，也常被人们看做滋补品。其成分主要有黄酮类化合物以及柠檬烯和皂素。

黄酮［1-9］类化合物也称类黄酮，是具有乙─苯基吡喃酮结构的一类黄色素。黄酮类化合物在植物界分布很广，主要存在于芸香科、豆科、伞形科中。类黄酮对缓解头痛、抑制血小板凝结、防癌抗癌、消炎、抗溃疡、降血糖等都有非常显著的功效。类黄酮可以从食物中获得，也可以从富含黄酮类化合物的植物中提取。对从砂仁中提取总黄酮的工艺进行了研究，现将有关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

砂仁，购于汉中市市场;无水乙醇，石油醚，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝，所用试剂均属AR级;芦丁 ［中国医药 (集团)上海化学试剂公司］，为生化试剂。

电热恒温鼓风干燥箱 (上海森信实验仪器有限公司)，粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)，电热恒温水浴锅 (北京科伟永兴仪器有限公司)，722E型分光光度计 (上海光谱仪器有限公司)，AL204-IC型电子天平 (上海志荣电子科技有限公司)，800型离心沉淀器 (上海手术器械厂)，SHB-III型台式循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)和索式提取器 (金坛市晶玻实验仪器厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

将砂仁去壳后置于60℃的烘箱烘干，粉碎，用石油醚回流除去色素和脂，风干，待用。

1.2.2 最大吸收波长的确定

精确称取经充分干燥的芦丁样品15mg，用乙醇定容至100mL容量瓶中，配制成0.15mg·mL-1的芦丁标准溶液。用移液管移取 1.00mL芦丁标准溶液于25mL容量瓶中，加入30%的乙醇溶液8mL，再加入5%亚硝酸钠溶液0.4mL振荡放置5min;加10%硝酸铝溶液0.4mL，摇匀，再放置5min;加4%氢氧化钠8mL，用30%乙醇定容至刻度。10min后，以加入 5% 亚硝酸钠、10%硝酸铝和 4%氢氧化钠的30%乙醇溶液为空白对照，用1 cm比色皿在480～570 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长。

1.2.3 标准曲线的绘制

精确称取经60℃干燥至恒重的芦丁标准品20.0mg，以60%乙醇溶解定容至100mL的容量瓶中，配制成0.2mg·mL-1的芦丁标准溶液。准确 吸 取 0.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00mL，分别置于25mL的容量瓶中，各加30%乙醇溶液至8mL，再加5%亚硝酸钠溶液0.4mL，振摇后放置6min;加10%硝酸铝溶液0.4mL，振摇后放置6min;加4% 氢氧化钠溶液8mL，最后用30%乙醇定容至刻度，放置10min后，以相应的溶剂做空白，在试验确定的最大吸收波长下测其吸光度。以浓度 (x，mg·mL-1)为横坐标，以吸光度 (D)为纵坐标，绘制芦丁浓度与吸光度标准曲线。

1.2.4 总黄酮含量的测定

称取1mL浸提滤液按照1.2.2过程处理后测定其吸光度。参照标准曲线，算出黄酮的提取率，其计算公式为:黄酮提取率/%=总黄酮的浓度(mg·mL-1) ×的稀释倍数 ×提取液体积 (mL)×10-3×100/砂仁样品的质量 (g)。

1.2.5 单因素试验

以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为4个单因素，固定其中某3个因素以1个因素为变量分别进行试验，研究4个变量各自对总黄酮提取效率的影响。

乙醇浓度。称取1.000 g砂仁样品粉末5份，在提取温度为60℃，料液比为1∶70、分别以50%，60%，70%，80%，90%的乙醇浓度提取2 h。过滤，滤液按1.2.2的方法处理后测定吸光值。每一变量下都做平行试验。

料液比。称取1.000 g样品粉末5份，在乙醇浓度为 80%，温度为60℃，以料液比为1∶50，1∶60，1∶70，1∶80，1∶90的比例提取 2 h，过滤，滤液按照1.2.2的方法处理后测定吸光值。每一变量下都做平行试验。

提取温度。称取1.000 g砂仁样品粉末5份，在乙醇浓度为 80%，料液比为1∶70，以40℃，50℃，60℃，70℃，80℃的温度提取 2 h。过滤，滤液按1.2.2的方法处理后测定其吸光值。每一变量下都做平行试验。

提取时间。称取1.000 g样品粉末5份，在乙醇浓度为80%，温度为60℃，料液比为1∶70，分别提取1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h。过滤，滤液按1.2.2的方法处理后测定其吸光值。每一变量下都做平行试验。

1.2.6 正交试验

在单因素实验结果的基础上，以乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度为因素，选用L9(34)正交［8-11］表确定最佳的提取工艺 (表1)。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长和标准曲线

以试验所用的722E型分光光度计在480～570 nm的范围内扫描芦丁标准试液，发现在508 nm处有最大吸收值，此即为最大吸收波长。

表1 砂仁总黄酮提取正交试验结果

按照1.2.3方法进行标准曲线的绘制，得到芦丁浓度与吸光值的回归方程式为:D=10.434x+0.0017，R2=0.9985，表明芦丁浓度在这一范围内线性关系良好 (图1)。

图1 芦丁含量的标准曲线

2.2 单因素影响

2.2.1 乙醇浓度

从图2可以看出，在随着乙醇浓度的增加总黄酮的提取率也随之增加，当乙醇浓度增加至80%时达到最大值，继续增加乙醇浓度则发现总黄酮的提取率有所下降。这是由于乙醇浓度的增加，一方面使整个提取液的极性增加，与砂仁中黄酮类化合物的极性不相符，黄酮类化合物不能很好的溶入提取液中;另一方面，乙醇浓度增大后一些脂溶性物质开始溶入提取液，这些物质和黄酮类化合物发生与乙醇—水分子结合的竞争，从而导致黄酮类化合物的提取率下降。

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.2.2 料液比

由图3可以看出总黄酮的提取率随料液比的增大而增大，当料液比达到1∶80时达最大值，之后继续增大料液比总黄酮的提取率反而下降，这表明在料液比为1∶80时总黄酮已经很好地溶解在乙醇中。因此最佳料液比应为1∶80。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响

2.2.3 温度

图4看出，随温度的升高，总黄酮的提取率随着升高，在60℃时达到最大值。这是因为温度升高分子运动加快，乙醇溶液容易浸入砂仁细胞，使黄酮类化合物更好地溶于乙醇中。继续升高温度后总黄酮提取率略有下降，这是因为温度过高，使黄酮类化合物氧化或分解，导致有效提取量下降［6］，直接反映出吸光度下降。这表明60℃为最佳提取温度。

图4 温度对总黄酮提取率的影响

2.2.4 提取时间

从图5可以看出随着提取时间的延长，乙醇能充分浸入砂仁细胞中，使得提取率随之提高。当时间超过2.5 h后提取率呈下降趋势。这是因为:一方面提取时间延长砂仁中脂类物质较多溶于提取液，与黄酮类化合物竞争与乙醇—水分子的结合;另一方面时间延长部分黄酮类化合物会被氧化或分解，所以导致提取率下降。由此可知，2.5 h为最佳提取时间。

图5 提取时间对总黄酮提取率的影响

2.3 多因素影响

由表1可知，4个试验因素对砂仁总黄酮提取率的影响强弱次序为:乙醇浓度＞温度＞料液比＞提取时间。最佳提取条件为A3C2D2B2，即用80%的乙醇浓度、60℃、1∶80的料液比，提取2.5 h的提取率最高。

3 小结与讨论

试验结果表明，砂仁中总黄酮用乙醇提取的最佳条件为80%的乙醇浓度，60℃ 的提取温度，1∶80的料液比提取2.5 h。以乙醇作为提取溶剂可以除去一些亲水性蛋白质、多糖、及其他水溶性杂质，提取液中有少量沉淀，可用离心的方法除去沉淀。另外，以乙醇做提取溶剂毒性较小，价格便宜。

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