WRKY转录因子在防御反应中的信号转导网络及其功能研究概况

王春玲，徐祥彬，潘园园，应奇才，王慧中

(杭州师范大学 生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

在长期的进化中，植物形成了一系列抵御生物和非生物胁迫逆境的防卫反应机制。WRKY家族是近年来发现的植物特有的一类转录因子家族，在防卫反应中起到了重要的调节作用。WRKY家族最显著的特点是至少含有一段大约60个氨基酸的WRKY结构域，在其N端有保守的WRKYGQK序列，在C末端有一个锌指结构:C2-H2或 C2-HC。根据WRKY结构域的数量和锌指结构的组成可以将WRKY家族分为3类。Ⅰ类有2个WRKY结构域，且有C2-H2的锌指结构。Ⅱ类只有1个WRKY结构域，锌指结构与Ⅰ类相同，大多数发现的WRKY因子属于这一类。Ⅲ类也只有一个WRKY结构域，但锌指结构为C2-HC。当植物受到病原菌和SA等因子的诱导后，WRKY转录因子就会迅速表达积累，并与抗病相关基因上的 (T) (T)TGAC(C/T)序列 (W-box)特异性结合，从而启动防御，形成了一个复杂的WRKY调控网络。

1 植物天然免疫系统

植物先天性免疫系统包括相互关联的2个分支，即病原相关分子模式 (PAMP)激发的免疫反应 (PAMP-triggeredimmunity，PTI)和效应子(effector)激发的免疫反应 (effector-triggered immunity，ETI)，这2种免疫启动了高通量的转录重组。PAMPs是指病原微生物上有共同特征的分子，如鞭毛素、糖蛋白、脂多糖等，它能与植物细胞表面受体相识别，激活下游不同的信号途径，产生免疫反应。许多微生物分泌的有毒的effector进入宿主细胞，植物抗病蛋白 (R蛋白)能与其专一性识别进一步激活了防御反应。在拟南芥和其他高级植物中，PTI和ETI途径受不同防御反应途径调控，包括水杨酸 (SA)和茉莉酸 (JA)等激素信号网络所介导的抗病防御反应途径［1］。

大多数病原体激发了一个常规的相互联系的植物信号转导网络。WRKY转录因子家族参与了植物的免疫反应，是转录调控和抗病防御反应的关键调控子［2－3］。在拟南芥中，大量协同调控的防御基因启动子上WRKY转录因子结合位点 (C/TTGACC/T，W盒)的存在，为锌指型 WRKY转录因子在调控防御反应过程中起到广泛而重要的作用提供了旁证。

2 WRKY转录因子在植物防御反应中的作用

WRKY转录因子是植物中最大的转录调控子家族之一，是抗病防御反应的关键调控子，防卫反应信号传递网络的重要组成部分［4］。AtWRKY70的功能缺失易遭受Erysiphe cichoracearum和Botrytis cinerea等真菌类的侵害，遭受Erwinia carotovora和Pseudomomonassyringae等细菌类的侵害。AtWRKY70是基础防御反应和完整的R基因介导的抗病反应，以抵抗Hyaloperonospora卵菌疫病侵袭所必需的调控因子［5－6］。AtWRKY52/RRS1 赋予拟南芥对Ralstonia solanacearum的抗性，但编码的蛋白质可作一种R蛋白［7］。AtWRKY33的突变使拟南芥更易遭受B．cinerea和Alternaria brassicicola感染［8］。WRKY可作负调控子，在AtWRKY7和AtWRKY11/AtWRKY17突变体中，受有毒P．syringae菌株激发的植物基础抗性免疫反应加强［6］。

AtWRKY18，AtWRKY40和AtWRKY60在调控植物抗病反应过程中具有重要的功能。Xu等［9］发现AtWRKY18/AtWRKY40和AtWRKY18/AtWRKY60的双突变体更耐P．syringaeDC3000的侵袭，但更易感染B．cinerea，AtWRKY18/AtWRKY40双突变体也高效的抵抗有毒粉状霉菌Golovinomyces orontii。这些结果表明在植物防御反应中WRKY因子有着正调控和负调控的作用。与此相一致，AtWRKY18单独过量表达导致了植物对P．syringae基础免疫反应的加强，而AtWRKY18与其他ⅡaWRKY成员一起过量表达与此结果完全相反。有2个WRKY因子 (AtWRKY53和AtWRKY58)已被确定为SAR的调控子，其中 AtWRKY53为正调控子，AtWRKY58 为 负 调 控 子［10］。在 拟 南 芥 中，将AtWRKY48的T-DNA插入突变体和过量表达植株感染细菌病原体P．syringae，结果发现在插入突变体中，SA调控的PR1的诱导表达增加，提高了植物的抗病性，而在过表达植株中，由于PR基因表达减少，增强了P．syringae的生长和对该病原菌的敏感性。因此，对于PR基因的表达和对P．syringae的基础抗性来说，AtWRKY48是一个负调控因子［11］。AtWRKY3和 AtWRKY4对坏死营养型病原体抗性反应起积极作用，而在抗活体营养型病原体时，WRKY4对其产生消极作用［12］。

水稻WRKY转录因子在抗病防御反应中发挥着重要作用。如OsWRKY53和OsWRKY71的过量表达能够促进防御反应相关基因，包括病原相关蛋白基因如PBZ1的表达，并且增强了水稻对Magnaporthe grisea的抗性，表明水稻OsWRKY53/71在诱导子诱导的防御信号途径中起着重要作用。水稻Xa21基因赋予水稻对Xanthomonas oryzae pv．oryzae(Xoo)的抗性，转录因子OsWRKY62因子能与Xa21相结合并表达2种蛋白质，分别是OsWRKY62.1和 OsWRKY62.2。在转基因植物中过量表达OsWRKY62.1就会消弱植物基础防御反应，而过量表达OsWRKY62.2就会抑制防御相关基因的表达激活，因此在水稻自然免疫中OsWRKY62作为一个负调控子，为水稻基础防御反应和特异防御反应的关键介导子［13］。在SA介导的防御信号体系中，WRKY45起正调控作用，能提高水稻的抗病性。OsWRKY31基因的过量表达能增强水稻抗M．grisea的感染，同时引起下游防御相关基因如PBZ1等的组成型表达，可能是生长素效应和防御反应信号转换途径的一个作用元件［14］。

3 WRKY转录因子保守的结构序列及防御作用

WRKY转录因子除了WRKY结构域的核心序列之外还有一些保守的结构特点。这些结构很可能功能性地将单个的WRKY分子彼此连接起来或者将单个的WRKY分子与另外的防御性信号元件连接起来。WRKY25和WRKY33因子的D motif是保守的，能通过核定位的耦合因子MKS1介导而被MPK4磷酸化，MPK4是一种抑制水杨酸信号途径的MAP激酶，这种保守的D motif存在于许多Ⅰ类WRKY转录因子的N末端。D motif的一个显著特点是有一个保守的Ser-Pro二聚体分子模式，它是受MAP激酶磷酸化的优先位点。烟草Ⅰ类WRKY因子，含有D motif的NtWRKY1因子能被SIPK因子磷酸化［15］。在体外，SIPK介导的磷酸化能增强W盒与NtWRKY1的结合活性，SIPK与NtWRKY1的协同表达导致植物快速的过敏反应。

拟南芥Ⅱa WRKY蛋白的N端亮氨酸拉链基序介导这种类型成员之间的同源二聚化或异源二聚化。在体外Ⅱa代表成员:水稻的OsWRKY71，大麦的HvWRKY1和HvWRKY2被发现能够进行同源性连接［16］。环境条件，突变体，或者过量表达引起的集中干扰能够影响不同ⅡaWRKY二聚体之间的平衡，因此改变了植物体-病原体互作的结果。

在Ⅱd WRKY成员中发现保守的Cmotif，构成一个钙调蛋白结合域，能感知病原体引发的细胞内Ca2+水平的波动并作出反应。还有独立于 WRKY区域的锌簇，其严格保守的残基序能加强WRKY因子与 DNA的亲和力。AtWRKY7和 AtWRKY11作为转录抑制子与其保守结构特点密切相关［17］。

4 WRKY网络存在的证据

植物免疫反应与大量不同的WRKY转录体和蛋白质协同一致的调节相联系。在拟南芥中，SA依赖的防御反应一旦激发，至少有49个AtWRKY基因表现了差异表达［6］。利用拟南芥突变体研究发现，WRKY基因能积极或消极的影响其他基因家族成员的表达［18］。水稻在非生物胁迫和激素处理条件下，有54个WRKY基因在转录水平上表现了极大的不同，其中有28个基因受这2种处理方式调控，表明在非生物胁迫和激素信号途径之间也有WRKY因子相互作用［19］。在油菜中，大量的BnWRKY蛋白参与了真菌病原体和激素刺激引起的防御反应相关基因的转录调控［20］。以上说明，WRKY基因通过自主调控和交叉调控机制来进行功能性的连接，它们形成了基因转录网络的核心，这个网络伴随着其它信号元件，控制大量的抗病基因。此外，这个WRKY网络由正调控和负调控元件构成，这些元件能让防御信号有效且不失均衡的扩增和多样化［6］。

5 WRKY因子构成的信号转导网络

病原菌上的PAMP与PRR的识别激发了细胞防御信号，引发了 MAPK级联反应［21］。经过不同的蛋白激酶磷酸化反应，含有 D motif的Ⅰ类WRKY因子首先被蛋白激酶MPK4磷酸化，激活的WRKY因子一方面调节SA和JA依赖的免疫反应之间的平衡，另一方面WRKY因子也与自身的W盒结合，从而促进抗病基因的表达，进行防御反应。病原诱导性的ICS1基因的表达激发了SA的产生，ICS1基因可能是WRKY因子的一个靶基因，因为ICS1的启动子有丰富的W盒。SA的产生使细胞质内低聚化的NPR1解聚，NPR1进入细胞核内。对于NPR1，一部分WRKY转录因子是它的转录靶目标，同时其本身也受WRKY因子调节表达。像8种WRKY基因 (AtWRKY18，－38，－53，－54， －58， －59， －66和 －70)都是 NPR1的靶基因，NPR1与TGA转录因子在基因的启动子位点相互作用，促进这些WRKY因子的表达，进一步启动下游抗病基因的表达，其中WRKY70能促进SA依赖的抗病基因的表达，抑制JA依赖性的抗病基因的表达。病原菌分泌的效应子如AVR一旦进入细胞便迅速与抗性蛋白 (R蛋白)识别，激活的R蛋白激发了ETI途径，最终获得抗病性。同时效应子与一些WRKY因子相互作用，进一步抑制了PAMP依赖的基础免疫反应，这种负反馈机制似乎提供了PTI与ETI之间的功能型接口［16］，与 PTI相比，ETI对病原菌防御反应更快，作用更强。

作为对PAMP处理的反应，PcWRKY1转录体快速的积累，AtWRKY33和 OsWRKY53能够被相关刺激激活并参与防御反应，这种快速的反应是通过3种协同作用的W盒的保守排列介导的［22］。通过免疫沉淀反应和基因组微阵列，AtWRKY51被确定作为一个潜在的SA依赖性的TGA2的下游靶蛋白［23］。拟南芥AtWRKY62能够被 SA和 MeJA 2种物质协同诱导表达，AtWRKY62的基因敲除突变体和过量表达植株显示，AtWRKY62能启动下游NPR1的表达，而NPR1能够促进SA免疫途径并抑制JA途径［24］。对 T-DNA插入突变体中和转基因过表达株系进行分析，WRKY25是P．syringae引起的SA介导的防御反应的一个负调控子［25］。热胁迫诱导的AtWRKY39能调控SA和JA信号途径之间的协同作用，提高了拟南芥的耐热性，AtWRKY25 在耐热性方面也发挥了作用［26－27］。可见WRKY转录因子在PAMP激发转录级联反应的不同层次进行工作，并与 ETI激发途径，SA、JA等获得性免疫途径有着密切联系，表明WRKY网络具有复杂和广泛性特点。

6 WRKY转录因子的功能多样性

WRKY家族在非生物胁迫，衰老，损伤等方面也具有不同的调控作用。WRKY75是第一个被报道的参与营养物质匮乏调控和根生长发育的WRKY转录因子。WRKY3和WRKY6调控植物响应植食性昆虫对植物造成的损伤。WRKY34是花粉特异性的转录因子，对于冷胁迫下花粉的生长发育和成熟具有重要调控作用［28］。OsWRKY80是在水稻中发现的由于Fe过量而诱导产生的胁迫应答基因［29］。OsWRKY72能够干扰ABA信号和生长素运输途径之间的相互作用［30］。OsWRKY08独立于ABA信号途径能提高拟南芥的渗透胁迫耐受性［31］。NtWRKY4参与了烟草叶子形态的构建及抗病毒 (TMV)防御反应。可见，WRKY因子参与了植物许多生理过程，随着研究深入，WRKY因子的其他功能也会被发现。

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