液基夹层杯技术用于基层实验室结核病诊断的可行性研究

宋红焕 季明 唐国锋 朱玮 朱澄玉 陈诚 许卫国 陆伟

液基夹层杯技术用于基层实验室结核病诊断的可行性研究

宋红焕 季明 唐国锋 朱玮 朱澄玉 陈诚 许卫国 陆伟

目的评价液基夹层杯法在基层实验室用于结核病诊断的可行性及安全性>。方法在泰兴、江阴CDC两个县级结核病实验室，对385例疑似肺结核患者的754份痰标本同时采用液基夹层杯法与直接痰涂片法进行镜检，结合临床诊断，比较2种方法的阳性检出率。采用四格表Fisher确切概率法进行比较，并进一步比较两种方法对不同性状、不同时间收集的痰标本的阳性率。选取12份阳性痰标本，设定不同的痰消化液比例，不同的消化时间，加热与否处理痰标本，将处理后的消化液接种到罗氏培养基，37℃培养，通过比较生长情况评价液基法的安全性>。结果液基夹层杯法、直接痰涂片法对754份痰标本的阳性检出率分别为23.5%（177／754）、16.8%（127／754），检测结果差异有统计学意义（χ2＝48.02，P＝0.000）；比较不同性状、不同时间采集的痰标本采用两种方法的检测结果，得出脓痰直涂法阳性检出率为40.9%（81／198），液基法阳性检出率为47.5%（94／198），两种方法对于脓痰的检测结果差异有统计学意义（Fisher确切概率法，P确切概率＜0.001）；非脓性痰（包括血痰、黏液痰、口水痰）直涂法阳性检出率为4.7%（9／193），液基法阳性检出率为13.5%（26／193），差异有统计学意义（P确切概率值均＜0.001）。安全性试验发现经消化液处理的痰标本，培养8周后未见结核分枝杆菌生长>。结论液基夹层杯法提高了疑似肺结核患者细菌学检查的阳性检出率，且操作简单、安全性高，适合在基层实验室应用并便于开展质量控制，是一种很有推广价值的检测方法。

结核，肺／诊断； 分枝杆菌，结核； 痰； 细菌学技术； 可行性研究

结核病是一种长期危害人类健康的重大传染病之一，我国是全球仅次于印度的第二大结核病高负担国家，对结核病做出快速、准确的诊断一直是结核病控制工作中的难点。目前，我国结核病防治规划结核病实验室主要检查方法是直接痰涂片镜检（简称“直涂法”），该方法操作简便，成本低廉，但灵敏度低；而传统的罗氏培养法周期较长（4～8周），目前最快的液体培养也需要10d左右，并且在痰标本前处理及后期培养过程中可能导致Mtb死亡，易产生假阴性结果。此外，部分实验室也采用传统的集菌法进行检测，但也存在操作过程繁琐、安全性不高等问题。如何研发、推广应用结核病病原体快速检测新技术是目前世界卫生组织、国内外结核病控制机构和组织所共同致力的研究工作。本研究探讨了国家科技重大专项研究的结核病诊断新技术——液基夹层杯法抗酸杆菌检验技术（简称“液基法”）在基层实验室应用的可行性，参照国际结核病诊断新技术的评价方法，进行了验证评价。

资料和方法

一、一般资料

1.资料来源：按照项目要求，收集艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项（2009ZX10004-904）示范区江苏省泰州市泰兴市CDC结核病门诊及无锡市江阴市CDC结核病门诊2010年1月至8月初诊疑似肺结核病患者385例，其中男性261例，女性124例，平均年龄（49.12±18.77）岁，年龄最小的20岁，年龄最大的90岁。每位患者按要求分别采集即时痰、夜间痰、次日晨痰3份痰标本，将符合要求的754份痰标本（标本量＞2ml）同时采用直涂法及液基法检测Mtb。选取泰兴项目点分析不同性状痰标本两种方法检测的阳性率，泰兴项目点共收集痰标本391份，其中口水痰29份、血痰12份、黏液痰152份、脓痰198份。所有入选患者的诊断均符合《中国结核病防治规划实施工作指南（2008版）》［1］规定的疑似肺结核诊断标准。实验分别在两个项目点实验室同时进行。

385例患者共收集痰标本1155份，其中401份标本因标本量太少（＜2ml）无法满足此研究方法的要求，最终有754份标本纳入本研究，其中即时痰332份，夜间痰288份，次日晨痰134份；泰兴391份，江阴363份；选取泰兴项目点收集的痰标本分析两种方法用于不同性状痰标本检测阳性率的比较，脓痰198份，非脓性痰（血痰、黏液痰、口水痰）193份。

2.试剂和仪器：液基法所用试剂及仪器均由湖南天骑医学新技术有限公司提供：TQ212型自动离心涂片机、彭氏杯为湘药管械（准）字2005第2410002；其专利号分别为200420036036.7、200520049875.7。消化液注册号：湘（怀）食药监械（准）字2005第1410005号。KP21型快速干片机、抗酸杆菌自动阅片计算机报告系统及抗酸染液试剂盒。罗氏培养基由江苏省CDC结核病参比实验室制备。

二、方法

（一）项目实施情况

项目实施分为预实验阶段和验证阶段。预实验阶段为期1个月，实验人员按照项目要求，同时采用直涂法和液基法对标本进行处理，目的在于使实验室人员熟悉项目的各项要求，并熟练掌握液基法的操作流程，为后期项目顺利开展提供良好的基础。预实验阶段，泰兴、江阴两个项目点的全部直涂法涂片和液基法涂片由泰州市CDC结核病实验室进行复核。预实验结束，由江苏省CDC结核病参比实验室对2个项目点进行考核，复核及考核结果合格后进入验证阶段，预实验数据不纳入统计范围，在验证阶段，采用的质量控制方式为泰州市CDC对2个点每个月随机抽取30%的痰涂片进行复核，及时发现并解决项目运行中产生的问题。具体方式为：每个月末统计两个项目点的实验室登记本该月的痰涂片总数，按照比例计算总抽片数，计算间隔＝痰涂片总数／总抽片数，按照此间隔随机进行抽片。痰涂片质量控制参照《中国结核病防治规划——痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［2］进行。

（二）实验方法

1.直涂法：按《中国结核病防治规划——痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［2］进行涂片、染色、镜检和记录结果。

2.液基法：具体操作按照说明书进行。

3.液基法安全性试验：液基法检测样本时首先采用标本消化液对痰标本进行处理，消化液的主要成分为含氯消毒剂，其作用主要为消化痰液，释放分枝杆菌；本方法检测时，除消化外的其他步骤均在生物安全柜外进行，故消化液的性能直接影响方法的安全性。本次实验选取直涂法结果4＋的痰标本12份，每份标本约2ml进行液基法安全性试验，设定不同的痰消化液比例（1∶1，1∶2），不同的消化时间（5、10、15min），加热与否处理痰标本，将处理后的消化液接种到罗氏培养基，37℃培养，观察其生长情况。

（三）统计学方法

Microsoft excel录入数据，配对资料采用配对χ2检验和确切概率法进行检验，SPSS 13.0软件进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、实验室检测结果

385例患者中直涂法检出涂阳患者64例，液基法检出88例；在754份痰标本中液基法检出阳性片177张，阳性率23.5%，直涂法检出阳性涂片127张，阳性率为16.8%。比较两种方法的阳性检出率，差异有统计学意义（χ2＝48.02，P＝0.000），对直涂法阴性，液基法阳性的24例患者做进一步分析发现，临床诊断均为涂阴肺结核患者。

二、不同性状痰标本阳性检出率比较

选取泰兴项目点收集的痰标本分析两种方法用于不同性状痰标本检测阳性率的比较，得出脓痰直涂法阳性检出率为40.9%（81／198），液基法阳性检出率为47.5%（94／198），两种方法对于脓痰的检测结果差异有统计学意义（Fisher确切概率法，P确切概率＜0.001）；非脓性痰（包括血痰、黏液痰、口水痰）直涂法阳性检出率为4.7%（9／193），液基法阳性检出率为13.5%（26／193），两种方法对于非脓性痰的检测结果差异亦有统计学意义（Fisher确切概率法，P确切概率＜0.001）。

三、不同时间收集痰标本阳性检出率比较

其中即时痰采用直涂法与液基法两种方法阳性检出率分别为15.1%（50／332）、20.5%（68／332）；夜间痰为17.0%（49／288）、25.7%（74／288）；次日晨痰为20.9%（28／134），26.1%（35／134），检测结果差异均有统计学意义（P确切概率值分别为＜0.001、＜0.001、＜0.05）。

四、液基法安全性试验结果

当加入1～2倍于标本的标本消化液，混匀后，不管加热与否，放置5～15min，接种于罗氏培养基上。37℃，培养8周后均未见Mtb生长（表1）。

讨 论

液基法为一种新型的集菌技术，与直涂法相比本质上是一样的。目前我国大多数县级基层结核病实验室仍采用直接涂片－抗酸染色技术作为结核病实验室诊断的主要技术，该技术操作过程简单、快速、成本低，但是灵敏度不高，有研究表明痰涂片检测诊断肺结核的灵敏度为20%～80%［3－5］，容易造成漏诊。液基夹层杯技术是对该方法进行改良和创新的基础上形成的，不仅保留了直涂法快速、直观、费用低的特点，而且还具有阳性检出率高、安全性高、标准化程度高等直涂法所不具备的优势。

表1 液基法安全性试验结果

液基法技术的创新主要体现在离心集菌、消化液处理痰标本方面，其作用主要有以下2个方面：一是彻底消化痰液、细胞，完全释放 Mtb；二是灭活Mtb，保障后期操作的生物安全，然后通过加热、高速离心，将释放出来已灭活的Mtb集聚到彭氏夹层杯底部的基片上，再进行染色镜检，其操作与直涂法基本一致。基于此创新点，该技术有阳性率高及安全性高的优势，本研究亦证实了这一点。

本研究中液基法对754份痰标本的阳性检出率为23.5%，直涂法为16.8%；比较两个方法的阳性检出率，差异有统计学 意义 （χ2＝48.02，P＜0.001）。分析不同性状痰标本两种方法检测结果的阳性率，得出脓性痰直涂法阳性检出率为40.9%，液基法阳性检出率为47.5%，非脓性痰直涂法阳性检出率为4.7%，液基法阳性检出率为13.5%；由数据可以看出，非脓性痰采用液基法，相对阳性检出率提高水平比脓性痰更为明显。笔者分析不同时间采集的痰标本采用两种方法的阳性检出率，其中即时痰采用两种方法阳性检出率分别为15.1%、20.5%；夜间痰分别为17.01%、25.60%；次日晨痰为分别20.9%、26.1%，差异均有统计学意义。对直涂法阴性、液基法阳性的24例疑似患者作进一步分析发现：临床最终诊断均为涂阴患者；另外有研究表明以培养法作为金标准，液基法诊断的灵敏度高于直涂法［6］，表明液基法在一定程度上提高了传染性结核病患者的发现率，对于结核病的防治工作有着重要的意义。

综上所述，液基法推荐的痰标本消化操作流程可以满足生物安全的要求。同时液基法可以批量处理标本，可以确保多个标本处理的一致性。此外标本收集、保存、用量可完全量化控制；标本消化、离心涂片、染色可量化操作；染色加温时的温度和时间可准确设定，整个过程便于标准化，保证了痰涂片的制备质量［7］。说明液基夹层杯法在基层实验室用于结核病诊断有一定的推广价值。

［1］中华人民共和国卫生部疾病预防控制局，中华人民共和国卫生部医政司，中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划实施工作指南（2008年版）.北京：中国协和医科大学出版社，2009：20-27.

［2］赵雁林，姜广路.中国结核病防治规划——痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册.北京：中国协和医科大学出版社，2009：7-14.

［3］Behr MA，Warren SA，Salamon H，et al.Transmission ofMycobacterium tuberculosisfrom patients smear-negative for acid-fast bacilli.Lancet，1999，353（9151）：444-449.

［4］Grzybowski S，Barnett GD，Styblo K.Contacts of cases of active pulmonary tuberculosis.Bull Int UnionTuberc，1975，50（1）：90-106.

［5］Urbanczik R.Present position of microscopy and of culture in diagnostic mycobacteriology.Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg A，1985，260（1）：81-87.

［6］杨华林，谭云洪，白丽琼，等.液基夹层杯技术检测抗酸杆菌应用性研究.中国防痨杂志，2011，32（5）：279-282.

［7］王改，曹青山，王金绳，等.夹层杯集菌离心涂片法检测痰抗酸杆菌对肺结核诊断价值的研究.中国民康医学，2007，19（8）：614.

Feasibility study of the Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique on diagnosis of tuberculosis in primary level labo-ratory

SONG Hong-huan＊，JI Ming，TANG Guo-feng，ZHU Wei，ZHU Cheng－yu，CHEN Cheng，XU Wei-guo，LU Wei.＊Chronic Infection Prevention，Jiangsu Center for Disease Control and Prevention，Nanjing210009，China Correspondingauthor：LU Wei，Email；jsjkmck＠163.com

ObjectiveTo evaluate the feasibility and security of Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique used for diagnosis of tuberculosis in primary level laboratory.MethodsIn two primary level laboratories of Taixing and Jiangyin Center for Disease Control and Prevention，754sputum samples from 385suspect TB patients were tested simultaneously by two methods：sputum smear and acid-fast staining microscopy examination （direct AFB）and Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique.According to clinical diagnosis，the positive rates of the two methods for the sputum samples with different traits or collected at different times were compared by Fisher probabilities in 2×2table.12bacterium-positive sputa were treated with different proportion of digestion liquid，different digestion time，and heating or not.Then the digestive sputa were inoculated at Roche medium at 37℃.The security of the liquid-based method was evaluated by preparing the growth of mycobacteria. Results The positive rates of Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique and the direct AFB were 23.5% （177／754）and 16.8%（127／754）respectively，which had significant difference（χ2＝48.02，P＝0.000）.The positive rates of these two methods in purulent sputa were 47.5% （94／198）and 40.9% （81／198），which had significant differences（P＜0.001）.The positive rates for the non-purulent sputa（including bloody sputa，mucus sputa and saliva sputa）were 13.5% （26／193）and 4.7% （9／193）（P＜0.001）.The sputum samples treated with the digestive liquid were not found the growth of Mycobacteria after the culture for 8weeks. Conclusion Liquid-based Peng’s interlayer vessel technique can improve the positive detection rate in suspect TB patients.It is simple，safe，and suitable for the application at primary laboratory for the diagnosis of tuberculosis and convenient for quality control.

Tuberculosis，pulmonary／diagnosis； Mycobacterium，tuberculosis； Sputum； Bacteriological techniques； Feasibility studies

“十一五”国家科技重大专项（2009ZX10004-904）

210009，南京，江苏省疾病预防控制中心慢性传染病防制所 （宋红焕、陈诚、许卫国、陆伟）；泰兴市疾病预防控制中心结核病防制科（季明、朱玮）；江阴市疾病预防控制中心结核病防制科（唐国锋、朱澄玉）

陆伟，Email：jsjkmck＠163.com

2012-01-10）

（本文编辑：张晓进）