体外冲击波对兔膝软骨细胞增殖的影响①

赵喆，刘春梅，白晓东，邢更彦

体外冲击波对兔膝软骨细胞增殖的影响①

赵喆1,2，刘春梅1，白晓东1，邢更彦1

目的 体外观察体外冲击波(ESW)对软骨细胞增殖的影响。方法酶法消化获得正常兔膝软骨细胞，体外分别施加0、1×105、1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、3.5×105Pa ESW 0、300、600、900次。倒置显微镜观察，HE染色观察，CCK-8染色筛选ESW促进软骨细胞增殖最佳压强和次数。结果1.5×105Pa、600次ESW干预后，软骨细胞增殖活性达最高；随压强、次数升高，软骨细胞增殖活性明显下降。结论软骨细胞是对ESW应力敏感细胞。ESW在一定压强和次数下显著促进软骨细胞增殖。

体外冲击波；软骨细胞；细胞增殖；应力细胞

[本文著录格式]赵喆，刘春梅，白晓东，等.体外冲击波对兔膝软骨细胞增殖的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(9): 824-826.

体外冲击波疗法(extracorporeal shock wave therapy,ESWT)作为骨科新的非侵入性治疗方法，在治疗某些软组织和骨疾病方面较传统方法存在优势[1]。临床研究显示，ESWT治疗距骨软骨损伤取得显著疗效，具有创伤小、方法简单、患者易于接受等优点[2]。2008年，国际骨肌系统冲击波疗法联合会(International Society for Medical Shockwave Treatment, ISMST)将距骨软骨损伤纳入其适应症。本研究体外观察ESW对软骨细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 2月龄新西兰兔3只：解放军总医院动物中心；胰蛋白酶、透明质酸酶、CCK-8试剂盒：美国SIGMA公司；Ⅱ型胶原酶：美国GIBCO公司；气压弹道式冲击波仪：瑞士EMS公司。

1.2 软骨细胞分离与培养 新西兰兔过量麻醉处死，酶法消化获得兔膝软骨细胞[3]，培养至第一代。将软骨细胞调整到2000/m l备用。

1.3 ESW干预 将2000/m l软骨细胞悬液分别移入7个5 cm2培养皿中各5m l。封口膜密封培养皿。将培养皿水平放置在气压弹道式冲击波探头上，中间放置橡胶囊并均匀涂抹耦合剂。施以0、1×105、1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、3.5×105Pa ESW 600次。培养皿移入超净台，去除封口膜，取细胞悬液100μl移入96孔培养板，每孔设5个复孔，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中孵育48 h，CCK-8法检测细胞增殖情况，确定ESW促进软骨细胞增殖的最佳压强。以此压强分别对第一代软骨细胞干预300、600、900次。CCK-8法检测软骨细胞增殖情况，确定最佳次数。实验重复3次。

1.4 检测方法

1.4.1 CCK-8法 孵育后细胞加入CCK-8 10μl，水平方向轻轻摇匀，再培养4 h。酶标仪在450 nm处测定吸光度。

1.4.2 细胞形态学观察和HE染色 根据筛选出的ESW促进软骨细胞增殖最佳参数干预实验组细胞，对照组不给予任何干预。细胞接种到预先置有灭菌盖玻片的6孔培养板，37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱孵育72 h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。贴壁细胞行HE染色，倒置显微镜镜下观察。

2 结果

2.1 形态学观察 倒置显微镜下，原代软骨细胞呈轮廓清晰的圆形，悬浮在培养液中。4 h后大部分细胞开始贴壁，细胞逐渐扁平透亮。24 h后软骨细胞出现突起，逐渐变成多边形。2 d后，软骨细胞连片生长，边缘细胞突起较长，细胞偏梭形，中央的细胞突起较短，呈多角形，似铺路石样改变。

2.2 ESW促进软骨细胞增殖最佳压强 在冲击次数固定为600次时，压强为1.5×105Pa时细胞增殖活性达到最高。同1.5×105Pa时比较，0×105、2.5×105、3×105、3.5×105Pa时细胞增殖活性下降(P＜0.05)。见图1。

2.3 ESW促进软骨细胞增殖最佳次数 压强固定为1.5×105Pa时，冲击600次软骨细胞增殖活性达最高。600次与0次比较，软骨细胞增殖活性有显著性差异(P＜0.05)，与900次比较无显著性差异(P＞0.05)。

2.4 HE染色 对照组软骨细胞呈三角型、梭型，胞浆较少、红染，细胞核呈深蓝色，较小，核仁不明显(图3)。实验组软骨细胞呈多角型，胞浆丰富、红染，伸出多个长的足突，细胞核较大，可见2～3个核仁(图4)。

图1 不同压强ESW下软骨细胞增殖活性

图3 对照组(HE染色,100×)

图4 实验组(HE染色,100×)

3 讨论

软骨细胞作为成熟软骨中唯一的细胞类型，在软骨损伤修复过程中起到维持内环境稳定的作用。越来越多的研究表明，软骨细胞增殖同软骨损伤疾病的预后密切相关，而软骨细胞的增殖、分化与细胞所受力学刺激密切相关[4]。当软骨细胞在体外培养和失去外界应力作用时，其正常功能、状态发生改变。Wu等通过三维培养原代人软骨细胞，发现机械刺激可以促进软骨细胞增殖，同时证明加入钙离子阻断剂可抑制细胞增殖[5]。伏治国等发现，软骨细胞外基质对软骨细胞具有明显的力学保护作用，压缩应力会影响软骨细胞的代谢活动[6]。

体外冲击波是一种连续的单一脉冲波，具有高压、压力骤升(＜10 ns)、短周期(10μs)的特点。冲击波由适当的振荡发生器产生，通过不同声阻抗的物质界面形成反射和折射。由于阻抗大的吸收压强多，阻抗小的吸收压强少，产生不同的效应。本研究显示，软骨细胞在1.5×105Pa、600次ESW干预下，增殖活性较对照组明显加快。另外，实验也表明，ESW只有在冲击次数达一定量时才能表现出促进软骨细胞增殖的效应，而冲击次数过度又将抑制细胞增殖，提示存在累积效应。王五洲等研究ESW对对成人骨髓间充质干细胞增殖分化影响时，发现5 kV、100次ESW可以明显促进细胞增殖及成骨活性[7]。王明波等发现，适当压强ESW具有促进软骨细胞促增殖因子碱性成纤维细胞生长因子和结缔组织生长因子的表达[8]。前者被认为是对软骨细胞作用最强的有丝分裂原，可显著促进软骨细胞增殖，而结缔组织生长因子在促进关节软骨修复过程中发挥重要作用。Renz等发现，ESW对藻酸盐中软骨细胞的膜通透性和DNA碎片情况无显著影响，认为ESW的临床应用对软骨细胞无副作用[9]。本实验结果证实，软骨细胞是一种对ESW应力敏感的细胞，在特定压强和冲击次数下可引起软骨细胞明显增殖，具有压强依赖性和积累效应。

软骨细胞如何将机械信号转化成为细胞生长、分泌和代谢等化学信号的具体过程，目前还不清楚。其主要调控机制可能是细胞骨架的改变，以及所导致的一系列分子信号的级联反应，最终实现对细胞的生长、分裂、蛋白质合成与分泌等的调控[10]。机械应力可使细胞外基质的间隙水流出，继而使细胞骨架发生位移与形变。Ingber等认为，机械信号的转导是一个比较复杂的过程，在归纳了最近的一些实验的基础上，提出外来应力首先作用于细胞骨架，使其发生移位或变形；而细胞骨架中的整合素与细胞表面的整合素受体结合，使细胞膜附近的局部粘连复合体发生改变，而局部粘连复合体与细胞骨架相连就会发生基于上述应力的细胞骨架形态改变以及信号转导分子的激活[11]。软骨细胞如何将ESW这一机械信号转化成促进软骨细胞增殖的作用机制，仍需深入研究。

综上所述，ESW作为机械应力在一定压强和次数的情况下显著促进软骨细胞增殖。证实软骨细胞是ESW应力敏感细胞，具有压强依赖性和积累效应。可供目前应用ESW治疗软骨损伤选用适当压强和次数时提供参考。

[1]崔海峰,苗旭漫,吴其常.体外冲击波疗法在创伤骨科领域的应用[J].中国矫形外科杂志,2009,(16):1230-1233.

[2]邢更彦,张鹏礼,史展,等.体外冲击波疗法联合踝关节镜治疗距骨骨软骨损伤[J].中国矫形外科杂志,2011,(12):978-981.

[3]Qing C,Wei-ding C,Wei-m in F.Co-culture of chondrocytes and bone marrow mesenchymal stem cells in vitro enhances the expression of cartilaginous extracellular matrix com ponents[J].Braz JMed Biol Res,2011,44(4):303-310.

[4]Onyekwelu I,Goldring MB,Hidaka C.Chondrogenesis,joint formation,and articular cartilage regeneration[J].JCell Biochem,2009,107(3):383-392.

[5]Wu QQ,Chen Q.M echanoregulation of chondrocyte proliferation,maturation,and hypertrophy:ion-channel dependent transduction ofmatrix deformation signals[J].Exp Cell Res,2000, 256(2):383-391.

[6]伏治国,董启榕.关节软骨细胞和细胞周基质的压缩特性及其对软骨细胞代谢的影响[J].医用生物力学,2008,(1):92-96.

[7]王五洲,邢更彦,井茹芳,等.体外冲击波干预对成人骨髓间充质干细胞增殖活性的影响[J].中国康复理论与实践,2006,12 (5):372-375.

[8]王明波,邢更彦,李志国,等.体外冲击波对体外培养兔关节软骨细胞增殖及bFGF、CTGF表达的影响[J].实用医学杂志, 2011,(7):1160-1163.

[9]Renz H,Rupp S.Effects of shock waves on chondrocytes and their relevance in clinical practice[J].A rch Orthop Trauma Surg,2009,129(5):641-647.

[10]Mammoto A,Ingber DE.Cytoskeletal control of grow th and cell fate sw itching[J].Curr Opin Cell Biol,2009,21(6): 864-870.

[11]Ingber DE.Tensegrity:the architecturalbasis of cellularmechanotransduction[J].Ann Rev Physiol,1997,59:575-599.

Effect of Extracorporeal Shock Wave on Chondrocyte Proliferation of Rabbit Knee in Vitro

ZHAO Zhe,LIU Chun-mei,BAI Xiao-dong,etal.DepartmentofOrthopaedic Surgery,GeneralHospital ofChinese People's Army Police Forces,Beijing 100039,China

ObjectiveTo observe the effect of extracorporeal shock wave(ESW)on proliferation of chondrocyte in vitro.M ethodsChondrocyte from normal rabbit knee using enzymatic digestion was treated w ith ESW of 0,1×105,1.5×105,2×105,2.5×105,3×105,3.5×105Pa 0,300,600,900 times in vitro.The pressure and frequency of ESW most promoting chondrocyte proliferation were determ ined w ith cartilage cellmorphology,HE staining and CCK-8 assay.Resu ltsChondrocyte proliferated most under 1.5×105Pa and 600 times of ESW,and decreased as the pressure and the frequency increased.Conclusion Chondrocyte is stress-sensitive in vitro.ESW can promote chondrocyte proliferation in certain pressure and frequency.

extracorporeal shock wave;chondrocyte;proliferation;stress cells

R681.3

A

1006-9771(2012)09-0824-03

2012-03-29

2012-06-05)

国家自然科学基金项目(31172169)。

1.武警总医院骨科，北京市100039；2.武警山西总队朔州支队，山西朔州市036002。作者简介：赵喆(1982-)，男，山西晋中市人，博士，主治医师，主要研究方向：关节外科，软骨损伤与修复。通讯作者：邢更彦。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.009