样本量对中苎1号群体遗传多样性参数的影响

谭龙涛，喻春明，陈平，王延周，陈继康，温岚，熊和平

(中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205)

作物品种纯度的快速、准确鉴定是作物品种资源保存、研究和利用过程中的一个重要环节。传统的方法是依靠种子或植株的表型性状来鉴别不同的个体，虽然该方法比较直观、简便，但由于可直接观测的农艺性状十分有限，而且有些性状要在特定的生育期才能检测，因此表型性状的检测受到很大限制，对亲缘关系较近的个体的检测则尤为困难。分子标记技术做为作物品种纯度鉴定的有效方法，现已广泛应用于水稻［1］、玉米［2］、棉花［3］、白菜［4］、大豆［5］等植物 。但是在植物居群遗传多样性的研究中，还存在着遗传多样性参数种类的确定，样本大小估测群体遗传多样性参数的可靠性等问题。

在遗传多样性比较过程中，选择恰当的遗传多样性参数和有代表性的样本量，使检测到的遗传多样性及其估算的参数具有较高的可信性［6－7］。赵茹等对野生大豆居群遗传多样性估算与取样策略的研究结果表明，不同分子标记检测到同一野生大豆居群的各种遗传参数值不同。同一居群中的不同样本量对遗传多样性参数的估算值有较大的影响，当选用多态位点百分率 (P)时，30－45个植株才能代表总体90%以上的遗传变异［8］。关于苎麻群体检测样本量的选择，还没有发现相关报道。

SSR标记具有共显性、多态性相对丰富、基因组覆盖较多等优点［9］，而且该技术简单快捷，稳定性高。现已广泛应用于遗传图谱的构建、遗传多样性分析和系统学研究方面［10－11］。SRAP标记具有高效、简便、重复性好、产率高、易测序、便于克隆目标片段的特点。目前已成功在作物遗传多样性分析、基因定位重要性状的标记、比较基因组学、遗传图谱的构建以及相关基因的克隆等方面得到广泛应用［12－14］。

本研究以中苎1号种子苗为研究材料，选取了31对SSR引物和48对SRAP引物进行分子标记，对苎麻品种的主要遗传多样性参数随抽样群体样本量的变化规律进行系统研究，为苎麻群体遗传多样性研究的取样策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为开放授粉中苎1号种子苗，栽培于中国农业科学院麻类研究所国家种质苎麻圃。

1.2 DNA的提取

由于苎麻叶中含有大量的酚类物质，为了获得较高纯度的基因组DNA，本试验对CTAB法进行了改良，通过延长抽提时间和加抗氧化剂的方法提高纯度。用BeckMan DU800分光光度计测定DNA的纯度和浓度，并稀释到约45ng/μL。

1.3 SSR和SRAP引物的来源

31对SSR引物和48对SRAP引物由中国农业科学院麻类研究所苎麻种质资源课题组提供。

1.4 PCR扩增和产物检测

SSR反应体系每25μL体系中含有DNA模板为45ng，引物0.15μmol/L，Taq酶用量1.5U，dNTPs为0.15mmol/L。反应扩增程序为:95℃预变性5min，94℃变性1min，50、55或60℃(根据引物的退火温度而定)复性50s，72℃延伸1min，30次循环后，72℃延伸5min。

SRAP反应体系为20μL，其中10×Tag buffer 2μL，dNTPs(5mmol/L)0.4μL，5’引物和3’引物 (0.1nm/μl)各0.6μL，Tag酶 (5U/μL)0.4μL，DNA 模板 2μL，加 ddH2O 至 20μL。反应扩增程序为:94℃预变性1min，94℃变性1min，33℃复性1min，72℃延伸1min，循环5次，然后94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃最后延伸5min。

1.5 数据处理

本试验从中苎1号种子苗群体中随机选取100蔸，并从中随机抽取10、20、30、40、50、60、70、80，90个个体组成抽样群体，计算其遗传多样性参数，每个抽样群体重复5次。分子标记结果采用人工读带的方法，将电泳图上可重复的、清晰的条带记为“1”，同一位置无带记为“0”，条带缺失数据记为“2”。用POPGENE2.0软件对整理的数据进行分析，计算不同抽样群体的遗传多样性参数的平均值，主要的遗传多样性参数有观测杂合度 (Ho)，期望杂合度(He)，shannon遗传多样性指数 (I)，遗传有效等位基因数目 (Ne)和平均等位基因数 (Na)。然后用SAS统计软件对抽样群体随样本量的增加遗传多样性水平变化趋势进行拟合分析。

2 结果与分析

2.1 SSR标记抽样样本量与遗传多样性参数的关系

表1显示了遗传多样性参数随着样本量的增加出现规律性的变化。观测杂合度和预期杂合度两个指标值在样本量90比样本量10减少了26.12%和24.93%;有效等位基因数、平均等位基因数和多样性指数随着样本量的增加呈现上升的趋势，而且变化较大，分别为49.73%、36.67%和120.68%。进一步研究发现，样本量小于50时，参数值变化较大，多样性指数变化了100.52%，平均等位基因数变化最小为23.37%。当样本量大于50时，参数值变化不大，变化最大为有效等位基因数19.43%，变化最小的是观测杂合度和预期杂合度，分别为0.76%和1.29%。

表1 样本大小对苎麻SSR遗传参数的影响Tab.1 SSR parameter values under different sample sizes of ramie

用SAS软件绘制遗传多样性参数随样本量变化的稳定性曲线 (图1)，结果显示观测杂合度、预期杂合度和多样性指数在样本量达到50后参数值变化较小。平均等位基因数的参数值在样本量达到30时变化就比较平稳。而有效等位基因数的参数值随样本量的变化呈现增加的趋势。

图1 苎麻SSR遗传参数随样本大小的变化曲线Fig.1 Curve of SSR parameter values under different sample sizes of ramie

2.2 SRAP标记抽样样本量与遗传多样性参数的关系

不同的分子标记对同一作物居群的样本量而获得的遗传多样性参数值差异很大 ［8］。用SRAP标记对不同样本量所得到的遗传多样性参数分析结果表明，观测杂合度和预期杂合度两个指标值在样本量90比样本量10分别减少了22.71%和17.82%。有效等位基因数、平均等位基因数和多样性指数随着样本量的增加呈现上升的趋势，分别增加了25.29%、10.49%和24.77%。而且当样本量小于60时，参数值变化较大，有效等位基因数和多样性指数变化了23.10%和23.20%，平均等位基因数变化最小为6.83%。当样本量大于60时，参数值变化不大，均在5%以下 (表2)。

表2 样本大小对苎麻SRAP遗传参数的影响Tab.2 SRAP parameter values under different sample sizes of ramie

图2 苎麻SRAP遗传参数随样本大小的变化曲线Fig.2 Curve of SRAP parameter values under different sample sizes of ramie

用SAS软件绘制遗传多样性参数随样本量变化的稳定性曲线 (图2)，结果显示观测杂合度、预期杂合度、有效等位基因数和多样性指数在样本量达到60后参数值变化较为平稳。平均等位基因数的参数值在样本量达到60以后仍有继续增加的趋势，但变化量较小。

3 讨论

用SSR和SRAP两种分子标记分析抽样样本量与遗传多样性参数的关系，结果显示群体抽样样本量对苎麻群体的遗传多样性参数值有不同程度的影响，对各遗传多样性参数影响并不一致，观测杂合度、预期杂合度和多样性指数在样本量达到一定值后变化较为平稳，有效等位基因数和平均等位基因数随样本量的增加变化规律不明显，但变化幅度都相应减少。

在SSR标记中群体抽样样本量对苎麻群体遗传多样性参数值有很大的影响，样本量小于50时，参数值变化幅度较大，当样本量大于50时，参数值变化不大，这说明利用遗传多样性参数来衡量苎麻群体的遗传多样性水平，需要50个样本以上。用SRAP标记估算群体的遗传多样性所需的群体抽样样本量达到60个时才能较好地反应总体的多样性水平。

在本试验中从某些参数值可以看出，虽然用小的抽样群体数量也可以估算遗传多样性参数值，但是小样本很难代表该群体的总体遗传多样性，可能会过高估计抽样群体的遗传多样性，并遗漏重要遗传多样性，此种抽样群体的取样策略与其他的研究结果相似［15－16］。

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［6］黎裕，王天宇，田松杰，等.利用分子标记分析遗传多样性时的玉米群体取样策略研究 ［J］.植物遗传资源学报，2003，4(4):314－317.

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