HPLC法同时测定绿茶中表没食子儿茶素没食子酸酯和咖啡因的含量

李元宏，田 华，陈吉炎（湖北医药学院附属太和医院药学部，湖北 十堰 442000）

绿茶在我国已有数千年的应用历史，因其具有多种生理作用和药理活性，人们对其研究越来越深入，尤其是绿茶中含量较高、用途广泛的茶多酚和咖啡因更是如此。茶多酚是一类多羟基酚类化合物的总称，具有增强机体抵抗力、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、降血压、抑菌、抗癌、抗辐射、抗病毒等重要作用[1，2]，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）含量最高，占40%～50%[3]。咖啡因是一种生物碱，具有增加肾脏血流量、强心、利尿、兴奋神经中枢、消除疲劳等作用。笔者以高效液相色谱（HPLC）法同时测定绿茶中EGCC和咖啡因的含量，以利于绿茶的质量控制[4]。

1 仪器与试药

LC-10A型HPLC仪、SPD-10A型紫外检测器（日本岛津公司）；HW-2000型色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；FA2004型电子分析天平（上海精科公司）；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率:150 W，频率:30 kHz）。

EGCG标准品（美国Sigma公司，纯度＞98%）；咖啡因对照品（中国食品药品检定研究院，批号:171215-200809）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。绿茶采自武当山八仙观茶场，经湖北医药学院生药学教研室陈吉炎教授鉴定为茶Camellia sinensis（L.）O.Ktze.的芽叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:DiamonsilTMC18（200mm×4.6mm，5 μm），加装Phenomenex保护柱；流动相:甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（25∶75）；流速:1.0mL·min－1；检测波长:278 nm[5]；柱温:30 ℃；进样量:10μL。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；1.咖啡因；2.EGCGFig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.caffeine；2.EGCG

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取经真空干燥至恒重的EGCG标准品和咖啡因对照品各适量，用甲醇配成每1mL中含EGCG 25.0mg和咖啡因5.0mg的混合对照品贮备液。精密量取该贮备液10mL，置100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取绿茶粉末约1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入乙醇25mL，超声处理30min，滤过，滤渣用适量乙醇洗涤，合并滤液，乙醇定容至50mL，摇匀。精密量取2mL，置蒸发皿中，挥干，残渣移入10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

2.4 线性关系考察

精密量取上述混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL，分别置10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取10μL，注入HPLC仪，每一浓度重复进样3次，求平均峰面积。以平均峰面积积分值（Y）为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，进行线性回归，得EGCG和咖啡因的回归方程分别为Y＝1.178×107X+5.947×105（r＝0.9994，n＝6）、Y＝2.376×107X－2.278×104（r＝0.9996，n＝6）。结果表明，EGCG和咖啡因的进样量分别在1.25～10.00、0.25～2.00μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10μL，重复进样6次，测定峰面积。结果，EGCG和咖啡因的RSD分别为0.76%和1.02%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号的绿茶粉末（约1.0 g）6份，分别按“2.3”项下方法制成供试品溶液，进样10μL，测定峰面积。结果，EGCG和咖啡因的RSD分别为1.21%和1.46%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、24h各进样10μL，测定峰面积。结果，EGCG和咖啡因的RSD分别为1.32%和1.63%（n＝6），表明供试品溶液在制备后24h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批绿茶粉末（约1.0 g）6份，分别精密加入混合对照品贮备液2mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液进样10μL，测定峰面积，计算样品含量和加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 样品含量测定

精密称取3批绿茶粉末各约1.0 g，分别按“2.3”项下方法制成供试品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液进样10μL，测定峰面积，计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Result of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

样品含量测定结果表明，不同批次的绿茶中所含的活性成分有一定差异，有的差异还很显著。可见，从有效成分层面来控制绿茶质量是不容忽视的问题。

由于绿茶所含成分比较复杂，除含量较高的EGCG和咖啡因外，还含有不少低含量或是弱吸收的成分。因此，用色谱方法来分析和控制绿茶质量时，色谱峰的分离度是必须注意的问题。试验中通过调整色谱条件使保留时间适当延长，各组分可获得较好分离。

综上所述，本方法简便、准确、重复性好，可用于绿茶的质量控制。

[1]袁晔蓉.浅谈茶多酚的研究进展[J].中国药房，2007，18（9）:700.

[2]贾淑平，曾 睿，但卫华，等.植物多酚药理作用的研究及应用[J].中国药房，2009，20（12）:953.

[3]仉燕崃，李 楠，韩国柱，等.表没食子儿茶素没食子酸酯的研究进展[J].中草药，2006，37（2）:303.

[4]李自勇，喻宗沉，徐小军，等.茶多酚含量与儿茶素含量关系研究[J].化学与生物工程，2007，24（11）:73.

[5]王菊萍，吕 萍.反相高效液相色谱法测定茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯的含量[J].中国现代医学杂志，2006，16（15）:2306.