非生物胁迫下植物体内活性氧产生和抗氧化机制的研究概述

班兆军，关军锋，李莉，冯建华，徐新明

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，济南 250014；2.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052；3.河北省农林科学院遗传生理研究所，石家庄 050051；4.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

非生物胁迫下植物体内活性氧产生和抗氧化机制的研究概述

班兆军1,2，关军锋3，李莉4，冯建华1，徐新明1

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，济南 250014；2.新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052；3.河北省农林科学院遗传生理研究所，石家庄 050051；4.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

在逆境胁迫下，植物细胞产生并积累大量的活性氧，如果活性氧的产生与清除无法达到平衡，超出植物清除活性氧的能力时，将发生氧化胁迫，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤，对植物个体造成氧化损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶类和非酶类保护机制。利用基因工程策略增加酶类和非酶类抗氧化剂在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。

活性氧；非生物胁迫；酶类抗氧化；非酶类抗氧化；氧化损伤

植物细胞通过氧化还原进行物质代谢、能量代谢和信息传递，执行许多重要的生理功能。在正常情况下，氧分子处于氧化态，不很活泼，但是，在有氧代谢过程中或在逆境胁迫下，细胞内产生的电子很容易使氧化态的氧转变为还原态的氧，产生超氧阴离子（O2·–）、羟自由基（HO·）、单线态氧（1O2）和过氧化氢（H2O2）等物质，这些物质被统称为活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）。植物体内产生的大量ROS，能够与脂类、DNA、RNA及蛋白质等大分子发生反应，对细胞产生毒害。植物体内又由于存在多种清除ROS的抗氧化机制（Antioxidants，AOX），使ROS维持在较低水平。目前的研究证明，ROS除了具有毒害作用外，还作为信号分子在植物生长发育以及应答逆境胁迫反应中起非常重要的作用。植物体内具有复杂的活性氧产生和清除机制，维持细胞内氧化还原状态的微妙平衡（图1），在避免过量活性氧造成的细胞伤害的同时，还能及时准确地应答上游的胁迫和发育信号，并介导下游复杂的生理过程。

图1 植物体内抗氧化和活性氧之间的均衡性Fig. 1 Equi librium between AOX and ROS in plant

1、植物活性氧的产生和产生因素

1.1 活性氧的产生

活性氧是细胞新陈代谢的副产物之一，是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称。活性氧之间在一定条件下可以相互转变。超氧阴离子是一种重要的ROS，它由氧分子接受一个电子而形成。O2在水溶液中易发生歧化反应生成H2O2，在酸性环境中高浓度O2的质子化产物HO·2更易发生此反应。与O2不同，H2O2不是自由基，而是一种更稳定的分子。在一般情况下，生物体内产生的H2O2常被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶清除，如果得不到及时清除，它可透过细胞膜，若膜外有Fe2+或者Cu+等金属离子存在时可生成HO·。HO·是化学性质最活泼的活性氧，具有很强的氧化作用，其寿命极短，可与周围的生物分子反应，产生不同反应性的二级自由基。

植物细胞的细胞壁、质膜、叶绿体、线粒体、过氧化物酶体和内质网等部位都可以产生活性氧。其中叶绿体、线粒体和过氧化物酶体是植物细胞中ROS产生的主要细胞器。叶绿体光合电子传递系统是植物细胞ROS的一个重要来源。叶绿素分子吸收量子后由基态上升到一个不稳定的、高能状态的激发态，在从激发态向较低能量状态的转变过程中，可以与植物体内的基态氧分子形成单线态氧（1O2），或通过电子转移形成O2·–、H2O2和HO·等活性氧自由基。高光强刺激下当吸收的光能超过CO2同化作用的能力时，叶绿体也能产生1O2。光系统II中激发的三线态叶绿素分子与O2相互作用也产生1O2[1,2]。UV辐射或强光胁迫引起的光抑制作用也会导致叶绿体内1O2和O2·–的产生[2,3]。在叶绿体光合电子传递链PSI的受体端有大量的自动氧化酶类存在，能够通过米勒反应将氧还原成超氧化物，O2·–可通过酶促反应歧化成HO2和O2[4]。

细胞内活性氧的另一个重要来源是线粒体。在线粒体呼吸链的电子传递过程中，大多数电子能通过呼吸链由色素氧化酶传递给O2，氧化生成H2O。但是，有l%～2%的单电子从呼吸链中漏出，直接传递给O2生成O2·–。O2·–很快被线粒体的超氧化物歧化酶（SOD）分解为H2O2，H2O2通过Fenton反应生成HO·。实验证明，当体内ATP生成过多、呼吸链上电子传递受阻时，会导致生成大量活性氧。加入呼吸链阻断剂如鱼藤酮、氰化物等，活性氧生成明显增多，说明线粒体是产生活性氧的主要部位。

过氧化物酶体也是H2O2产生的主要细胞器，叶绿体光呼吸形成的乙醇酸转移到过氧化物酶体后，在乙醇酸氧化酶作用下，生成乙醛酸和H2O2，另外过氧化物酶体中脂肪酸β-氧化过程中也有H2O2作为代谢副产物产生，嘌呤分解代谢途径也产生多种ROS[5]。植物细胞内在空间分布上与叶绿体和过氧化物酶体紧密相邻的线粒体，是另一个产生ROS的细胞器，线粒体呼吸链末端氧化酶把底物的电子传递到氧分子形成水或H2O2，哺乳动物细胞中，线粒体是ROS的主要来源，植物由于AOX（Al ternative Oxidase，交替氧化酶）的存在，线粒体中产生的ROS相对很低[6]。AOX与呼吸链中的复合体III（Cytbc1复合体）竞争电子，阻止泛醌库电位过度产生，限制线粒体中ROS的产生[7]。

细胞质膜上的氧化还原酶系统（Plasma Membrane Redox System，PMRS） 是 产 生 H2O2的重要部位[8]。在哺乳动物中，NADPH氧化酶亚基gp9Iphox是催化ROS产生的关键酶[9]。植物中质膜NADPH氧化酶也是H2O2产生的主要来源，但与哺乳动物不同，植物质膜NADPH氧化酶的活性直接受Ca2+结合激活[10,11]。除了质膜NADPH氧化酶外，在质外体还存在一些产生ROS的酶类。在植物-病原菌互作过程中，质外体的草酸氧化酶能催化草酸产生H2O2[12]。另外，多胺氧化酶（Polyamine oxidase，PAO）也是一种产生H2O2的重要酶类，在细胞质外体接受光、生长素、损伤等多种刺激调控，参与细胞壁的分化和防御应答过程[13,14]。

此外，细胞的内质网及某些酶类如环氧合酶、脂氧合酶、黄嘌呤/次黄嘌呤氧化酶等也可通过特定的化学反应产生O2·–。

2、非生物胁迫下活性氧的抗氧化清除机制

植物在不期望的非生物逆境胁迫下，特别是在强光、紫外线照射、干旱、低温、高温、机械和重金属胁迫下，会产生大量的ROS（例如1O2、O2·–、H2O2和HO·）。为了保护植物免受ROS毒害，植物细胞和细胞器（例如叶绿体、线粒体和过氧化物酶体）具有复杂的抗氧化防御机制（图2）。抗氧化防御机制包括酶类和非酶类两大抗氧化保护系统。酶类保护系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和谷胱甘肽还原酶（GR），非酶类保护系统包括谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（AsA）、类胡萝卜素（CAR）、甘露糖醇、维生素E（α-生育酚）和细胞色素f（Cyt f）。

2.1 酶类保护系统

2.1.1 超氧化物歧化酶（SOD，EC1.15.1.1）

SOD作为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞中多余的超氧根阴离子。SOD是金属酶，根据辅基部位结合的金属离子的差异，SOD可分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三种类型。研究普遍认为SOD是防止氧化胁迫的关键酶[15-18]。细胞中，O2·–易与H2O2反应形成HO·，HO·的氧化作用非常强，对细胞的损伤极大。SOD能很快催化O2·–形成H2O2和O2，防止HO·的形成，大大地降低了活性氧对细胞的毒害作用。SOD主要分布于线粒体、细胞溶质和基质中，线粒体中主要是Mn-SOD，胞质中主要是Cu/Zn-SOD，有的生物中还有Fe-SOD。低等植物细胞中，SOD以Mn-SOD和Fe-SOD为主，而高等植物中SOD以Cu/Zn-SOD为主。当非生物环境条件导致ROS形成增加时，SOD的表达增加。很多研究表明非生物胁迫下转基因植物中不同SOD的过量表达。利用基因工程策略增加酶类和非酶类抗氧化剂在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展（表1）。

图2 非生物胁迫下活性氧（ROS）产生和清除Fig. 2 ROS generation and scavenging under abiotic stress

2.1.2 过氧化氢酶（CAT，EC 1.11.1.6）

CAT是植物细胞中清除ROS最主要的酶之一，它催化H2O2形成H2O和O2。CAT主要存在于植物的过氧化酶体和乙醛酸循环体中。当植物大量产生ROS时，如植物在非生物逆境胁迫下，CAT起到了举足轻重的作用。在过氧化物体脂肪酸β-氧化中能大量产生H2O2，过氧化氢酶对于清除该H2O2具有十分重要的作用。CAT已得到纯化，该酶为同源四聚体，含有血红素。它能够直接分解活氧化一些底物，如甲醇、乙醇和甲酸等。植物中的CAT可分为三类，一类主要在清除乙醛酸循环中脂肪降解产生的H2O2；另一类主要在光合作用组织中存在，清除光呼吸中产生的H2O2；第三类存在于微管组织，参与植物木质素的合成。在玉米和其它的植物中已克隆到了CAT基因[19]。研究发现，CAT是C3植物中H2O2清除的关键酶，而且是C3植物耐受胁迫所必需的[20]。

2.1.3 抗坏血酸过氧化物酶（APX，EC1.11.1.11）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX，EC 1.11.1.9）

除过氧化氢酶外，植物细胞中还有能将H2O2转化为H2O的酶，如过氧化物酶（POD）。按供氢体不同，POD可被分为APX和GPX。APX也是清除H2O2的主要酶，具有特性各异的同工酶家族，根据其在植物细胞中的定位不同可分为：类囊体APX（tAPX）、叶绿体基质可溶APX（sAPX）、微体膜APX（gmAPX）和细胞质APX（cAPX）[21]。APX与CAT的不同之处在于，CAT不需要还原力，而且其酶活速率较高。但其对H2O2的亲和力较低。

研究发现GPX在清除ROS中也起非常重要的作用，GPX减少H2O2和脂质过氧化物，从而帮助植物细胞免受氧化刺激[22]。

2.2 非酶类保护系统

非酶类抗氧化剂分布于植物的不同亚细胞结构区域中，清除不同种类的活性氧。这类物质既可以直接同ROS反应，将其还原，又可以作为酶的底物在ROS的清除中发挥重要作用。

2.2.1 抗坏血酸（AsA）

研究表明抗坏血酸是植物中含量最丰富的清除ROS的水溶性抗氧化剂[23]。所有的植物组织都能合成抗坏血酸，通常在光合细胞和分生组织（某些水果）中含量更高。有报道表明叶肉细胞大约有20%-40%的抗坏血酸存在于叶绿体中，其中抗坏血酸的浓度高达50mM[24]。抗坏血酸的浓度在植物组织中能够达到毫摩尔级。抗坏血酸在植物的生长和发育中具有非常重要的作用[12]。抗坏血酸可以作为还原剂，直接与ROS反应，清除ROS，另外，它也作为酶的底物在ROS清除中扮演重要角色；抗坏血酸也能够在α-生育酚和玉米黄质的再生循环中充当还原剂；抗坏血酸的第三种功能是在叶绿体类囊体表面作为还原剂参与抗坏血酸过氧化物酶介入的过氧化氢的清除，在这一过程中，抗坏血酸被氧化为单脱氢抗坏血酸。在完全氧化的脱氢抗坏血酸产生的情况下，还原型谷胱甘肽可以通过谷胱甘肽还原酶得到还原。由于抗坏血酸在清除活性氧的过程中发挥了重要作用，故而在叶绿体中，这一与氧的摄入、APX的功能及分子氧还原相关的过程最近被称为“米勒-抗坏血酸过氧化物酶光呼吸”[19]。

2.2.2 谷胱甘肽（GSH）

GSH是由Glu-Cys-Gly组成的三肽，分还原型和氧化型两种，还原型GSH是植物中最重要的抗氧化剂，它可与氧化型GSH相互转化[19]。在植物中，GSH主要通过两种机制起作用，一是GSH与巯基反应，形成硫自由基（thjyl radical），与另一个氧化型的谷胱甘肽形成二硫键（GSSG）。二是与脱氢抗坏血酸反应，生成抗坏血酸或使蛋白质的二硫键断裂。

GSH在植物中分布广泛，在一些豆科植物中，GSH的含量较高。植物中GSH的水平随生长状态、年龄以及生长环境的不同而不同。一般说来，逆境下还原型GSH含量升高。如在光照条件中植物细胞胞质中GSH浓度可达到1-4 mmol/L。细胞内谷胱甘肽主要是以还原状态存在，大豆叶绿体中其含量大约占70%，而豌豆叶绿体中含量可达90%[17]。

GSH可以通过多种方式实现抗氧化作用，首先还原型GSH能作为供氢体，通过与脱氢抗坏血酸还原酶反应使抗坏血酸从氧化型转变为还原型，它也可通过非酶促反应，还原脱氢抗坏血酸；第二，还原型GSH能与单线态氧、HO·和O2·–等直接发生化学反应，清除ROS；第三，GSH还可以还原脂过氧化物使其形成脂酰过氧化物，从而达到稳定膜的作用。

2.2.3 维生素E

研究表明，生育酚尤其是其中的α-生育酚（Ve）是植物中重要的ROS清除剂。它主要通过捕捉活性氧及脂过氧化自由基调节膜脂的状态来稳定膜。另外它还能够与脂肪酸发生反应，形成复合物[19]。生育酚也可以直接淬灭单线态氧，还能通过与过氧化自由基反应，破坏碳自由基链式反应，导致碳自由基扩增反应的终止。

2.2.4 其他

在植物的光合作用过程中，类胡萝卜素（CAR）能够捕获叶绿素中产生的活性氧，保护光合作用系统，避免ROS对植物的伤害。类胡萝卜素主要通过以下机制起到抗氧化剂保护作用，一是与膜脂过氧化产物反应终止过氧化反应；二是通过与单线态氧反应降低其毒性；三是通过与基态或激发态叶绿素分子反应，防止单线态氧的形成；四是通过参与叶黄素循环防止过多的ROS产生[25]。此外，类胡萝卜素还能够增加生育酚捕获过氧化自由基的能力[26]。

类黄酮是近年来研究发现的主要的ROS清除剂。体外研究表明类黄酮可以直接清除活性氧。但在体内却未必如此，因为类黄酮主要定位于液泡，而活性氧离子并不能从叶绿体扩散至液泡中，因而在植物细胞中，类黄酮只能在活性氧的产生部位或附近部位进行清除，如液泡或细胞壁。而H2O2却比较稳定而且能够穿过生物膜，所以类黄酮在H2O2的清除中扮演极为重要的角色[27]。

脯氨酸（Proline）近年来被视为潜在的抗氧化和植物细胞程序性死亡的抑制剂。因此脯氨酸可以认为是一种动植物和微生物用来消除ROS不利影响的非酶类抗氧化剂[28]。植物中的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）催化谷氨酸经由Δ1-吡咯啉-5-羧酸（P5C）合成脯氨酸的过程[29]。游离脯氨酸被认为是一种蛋白质稳定剂、金属螯合剂、脂类过氧化物的抑制剂和1O2、HO·的清除剂[30]。甘露醇也被发现为有效的HO·的清除剂。

3、结论和展望

总之，各种非生物胁迫导致ROS产生过剩，从而对植物体产生毒性最终导致氧化应激。在非生物胁迫条件下，ROS或者自由基参与植物细胞中的各代谢过程，都有可能对植物细胞产生毒害作用。影响细胞膜的性质和可能导致核酸、脂类和蛋白质的氧化损伤，甚至影响它们的功能性。然而，植物细胞本身具有的清除自由基的抗氧化防御系统，这种抗氧化系统包括酶类（SOD、CAT、APX和GPX等）以及非酶类（抗坏血酸、谷胱甘肽、类黄酮、类胡萝卜素和脯氨酸等）。

植物体内提高抗氧化酶类活性及抗氧化剂物质含量，增强抗氧化代谢循环的水平，强化植物活性氧解毒体系，现已证实是提高植物胁迫耐性的有效途径。利用基因工程手段，在研究抗氧化酶类在清除活性氧方面的功能及作用中，SOD，APX，GR和CAT的大量表达提高了植株对氧化胁迫的抗性，植物对胁迫胁迫的耐性得到了不同程度的提高（表1）。

活性氧解毒系统是植物抗胁迫保护机制的一个主要组成部分，随着植物适应胁迫能力的增加，清除活性氧自由基能力也随之增加。对大量活性氧的适应是与植物抗氧化酶类活性增加相联系的。然而，由于胁迫反应中基因表达以及胁迫代谢的复杂性，许多抗氧化剂参与活性氧的清除过程，而且在氧化胁迫下，许多细胞组分需要保护，所以氧化胁迫抗性要求一个完整的、增强的抗氧化体系[31]。

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农业科技成果转化资金项目（2011GB24420002）

班兆军（1980- ），男，助理研究员，研究方向为果蔬采后生理及贮运保鲜，E-mai l:banzhaojun@yahoo.cn，电话:0531-88932575

冯建华（1960- ），女，研究员，主要从事农产品冷链物流、采后保鲜技术及保鲜材料的研究推广工作，E-mai l: jhfeng123456@163.com