蜜露检测法在转基因棉抗蚜性指标中的应用

周晓静，白素芬，李 欣，闫凤鸣

(河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002)

棉蚜是世界性的棉花重要害虫.发生严重时，排泄的蜜露污染棉叶和棉纤维，引起煤污病的发生，严重降低棉花的产量和品质.长期以来，世界各国都在致力于棉花抗蚜品种的选育，并力求通过转基因技术培育抗蚜水平高的转基因棉.抗蚜棉的选育必然涉及到抗蚜性鉴定，目前，有关抗蚜分级标准主要以蚜口密度减退率或蚜害指数减退率作为依据［1］.然而，蜜露作为棉蚜代谢的最终产物，1头棉蚜整个生长发育阶段排泄的蜜露可达2 220 μg，占其取食总量的70%以上［2］，排蜜量的多少能够反映棉蚜取食量的大小.已有的研究［3］还表明，蚜虫蜜露的排泄受寄主植物营养水平的影响显著，与不同材料的抗性密切相关.田间蚜虫发生量大的材料，蚜虫排蜜量大;相反，排蜜量小.芥蚜取食含有麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA)的人工饲料后，排泄的蜜露减少40%;取食转wga基因的印度芥后，与受体亲本相比，排泄的蜜露量显著下降，说明wga基因的表达，抑制了蚜虫的取食.进一步的研究表明，伴随排蜜量的下降，芥蚜的死亡率增加和生殖力下降［4］.国际水稻研究所已将蜜露检测作为评价水稻材料是否抗褐飞虱的一个简易指标.刘光杰等［5］通过白背飞虱(Sogatella furcifera)蜜露量，结合田间自然虫量调查获得了水稻材料抗白背飞虱的定量指标，证明蜜露量测定法可以用来测定水稻材料对白背飞虱的抗性水平.由此可见，蜜露可以反映寄主植物对蚜虫、飞虱等昆虫取食的影响，检测其排泄的蜜露量，可以作为评价寄主抗性的一个重要指标.有关蜜露量的测定方法较多，如蜜露滴计数法、蜜露色斑面积法即半定量法、称量法和比色法等.但是，何种方法更准确、有效、简易未见详细报道.本研究采用半定量法、称量法和比色法，比较了棉蚜取食不同转基因棉花后排泄的蜜露量，以期筛选出简便、准确的蜜露检测方法，为转基因抗蚜棉或棉花抗蚜材料的选育提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 供试棉花

供试棉花材料10个，即转Bt基因抗虫棉H2和其亲本中棉12，转Bt和CpTI基因抗虫棉中棉41和其亲本中棉23，转凝集素基因抗虫棉8008和其亲本苏006，转凝集素基因抗虫棉8009和其亲本苏011，转基因抗虫杂交棉晋棉34和常规棉太8作为棉蚜的取食寄主.10个棉花材料均在室内同期播种于花盆中，栽培、管理措施一致，苗期用于试验.

1.2 供试昆虫

棉蚜于2011－06采自河南原阳农科院试验基地.棉蚜饲养方法参照刘树生［6］的新的叶子圆片法加以改进，即将20 mL琼脂培养基(每1 L蒸馏水加2.5 mg 100万单位硫酸链霉素，再加质量分数为1%的琼脂配制而成)倒入容器内，容器选用无毒、透明的塑料杯，口径为8.7 cm，底部直径为5.5 cm，高为4 cm.然后将整片棉叶的正面贴在培养基表面，接蚜后，将整个容器倒扣在直径为9 cm的培养皿上.置于(25±1)℃，相对湿度60% ～70%，光周期L∶D=14∶10的人工气候培养箱中饲养.用此法饲养的棉蚜与在棉株上自然生长的棉蚜的个体大小和寿命没有明显差异，而且棉叶在培养基上能够保绿10 d以上.

1.3 蜜露的检测

1.3.1 半定量法－蜜露色斑面积法 在棉花苗期，挑取室内各棉花材料上饲养10代的无翅雌成蚜接在相应棉花材料叶片的背面(如前述，采用离体叶片饲养法)，每个培养皿内留5头初产仔蚜作为初始蚜，当若蚜发育至3龄或4龄时，在棉叶下方的培养皿内铺上经质量分数为1%的茚三酮浸泡并烘干的滤纸，24 h后取出滤纸，拍照并用九宫格坐标纸测量滤纸上斑点面积.每个棉花材料重复3次.

1.3.2 定量法－称量法 在棉花苗期，挑取室内各棉花材料上饲养10代的无翅雌成蚜，接在相应材料棉花叶片的背面，每个培养皿内留15头初产仔蚜作为初始蚜，当若蚜发育至2龄时，在棉叶下方的培养皿内放置已称重的Parafilm膜，72 h后取出膜用电子天平称重(精确度0.000 1 g)，2次膜质量的差值即棉蚜取食该棉花材料后排泄的蜜露量.

1.3.3 比色法

1.3.3.1 氨基酸最大吸收峰的确定 称量2.879 mg脯氨酸溶于 300 μL 溴甲酚绿(0.001 g·mL－1)，再加3 mL体积分数为95%乙醇后用Spectrum756型紫外可见分光光度计在570～700 nm波长范围内比色，以确定氨基酸最大吸收峰的波长.1.3.3.2 棉蚜不同种群密度的排蜜量 分别接50，80，110头3龄若蚜于中棉12的棉叶上，在棉叶下方铺Parafilm膜，48 h后取出膜，用300 μL溴甲酚绿分2次在膜上收集蜜露再转移到试管中，再用3.4 mL体积分数为95%乙醇分2次洗脱后集中在试管中，用紫外可见分光光度计测其在628 nm下的吸光度值.

1.3.3.3 棉蚜取食不同棉花材料后排蜜量的检测

在供试的10个棉花材料的棉叶上接成蚜，待其产够15头若蚜后移除成蚜，当若蚜发育至2龄时，在棉叶下方放置Parafilm膜收集蜜露，72 h后取出膜，排蜜量测定方法同 1.3.3.2.

1.4 数据分析

各处理平均数间的比较采用Duncan’s新复极差法.

棉蚜排蜜量减少率X=［Y1(OD对照受体亲本)－Y2(OD转基因棉)］/X1(对照受体亲本上的棉蚜数).

2 结果与分析

2.1 半定量法反映棉蚜取食不同转基因棉后排蜜量的变化

棉蚜在取食所有供试的10个棉花材料后均能正常排泄蜜露，排泄蜜露量的多少与取食量大小呈正比.通过半定量法即测量棉蚜取食后排泄蜜露的色斑面积，即可从蜜露色斑的面积差异反映其取食量的差异.

由表1可以看出，供试的10个棉花材料对棉蚜的取食产生不同的影响，反映在棉蚜取食后蜜露的排泄量呈现差异，它们对棉蚜的适合性依次为中棉12＞8009＞中棉41＞H2＞苏011＞中棉23＞8008＞苏006＞晋棉34＞太8，其中中棉12最适合棉蚜的取食，其上棉蚜的排蜜量最高，蜜露色斑面积为105.67 mm2.与之相反，常规棉太8对棉蚜取食有一定的抑制作用，其上棉蚜的排蜜量最少，仅为18.67 mm2.取食转外源凝集素基因棉8008，与其亲本苏006相比，棉蚜排蜜量增多，说明该凝集素并未发挥抗蚜作用.以上各转基因棉与其受体亲本相比，除8008与其亲本苏006外，抗蚜性差异均未达到显著水平.

表1 取食不同转基因棉对棉蚜排蜜量的影响Table 1 Effects of different transgenic cottons on the honeydew excretion by Aphis gossypii

2.2 称量法反映棉蚜取食不同转基因棉后排蜜量的变化

待棉蚜在各供试棉花材料上取食一定时间后，富集在膜上的蜜露量积累到可以检测的水平，此时称量膜的质量，获得棉蚜的排蜜量.

由表2得出，取食中棉12棉蚜的排蜜量最高，取食太8排蜜量最少，取食转外源凝集素基因棉8008，与其亲本苏006相比，排蜜量更多，更适合棉蚜的取食.该结果与上述半定量法的测定结果基本一致，说明称量法和半定量法均能较好的反映棉花材料或转基因棉对棉蚜取食后蜜露分泌的影响.

表2 棉蚜取食10个棉花材料后的排蜜量Table 2 The amount of honeydew production by Aphis gossypii feeding on ten cotton varieties

2.3 比色法反映取食不同转基因棉后对棉蚜排蜜量的影响

2.3.1 氨基酸最大吸收峰波长的确定 为确定溴甲酚绿比色法测定氨基酸的最大吸收峰时的波长，在波长范围570～700 nm条件下进行测定，如图1显示，氨基酸最大吸收峰时的波长为628 nm，故选择628 nm为测定波长.

图1 不同波长下脯氨酸的吸光度值Fig.1 The absorbance value of proline at different wave length

2.3.2 蚜口密度与棉蚜排蜜量的相关性 理论上，棉蚜蚜口密度与其排泄的蜜露量呈正相关性，即蚜口密度高时，排蜜量大;否则，排蜜量小.

由图2可知，采用比色法很好地反映了棉蚜在不同蚜口密度的排蜜量，排蜜量与蚜口密度的回归方程为:y=0.013 5x－0.532 3.x为蚜虫数量，y为吸光度值.

图2 棉蚜不同蚜口密度与其排蜜量的相关性Fig.2 The relationship between aphid density and honeydew production

二者成显著的正相关，相关系数达0.998 8.由此可见，用此法可检测棉蚜取食不同棉花材料或转基因棉后，蚜口密度的增长情况，排蜜量大，则相应的蚜口密度也高;相反，则蚜口密度低.

根据棉蚜排蜜量与蚜口密度的相关性，可以计算出蚜口密度减退率达20%时，棉蚜排蜜量的减少率 X=0.002 7.

其中，X=［Y1(OD对照受体亲本)－Y2(OD转基因棉)］/X1(对照受体亲本上棉蚜数).

蚜口密度减退率为80%时，棉蚜排蜜量的减少率为 X=0.010 8.

由此推测出转基因棉抗蚜分级标准见表3.

2.3.3 棉蚜取食不同转基因棉后排蜜量的变化采用溴甲酚绿比色法测定棉蚜取食各转基因棉后的排蜜量，结果见表4.

表3 转基因棉对棉蚜抗性分级标准(排蜜量减少率)Table 3 The criterion of resistant classification of transgenic cottons to aphid(reduction of honeydew excretion by Aphis gossypii)

表4 棉蚜取食不同转基因棉后的排蜜量Table 4 The amount of honeydew production by Aphis gossypii feeding on different transgenic insect resistant cottons

由表4可知，棉蚜取食中棉12的排蜜量最大，而取食太8后排蜜量最小，取食其他材料后的排蜜量与上述半定量法和称量法的趋势基本一致，这表明3种方法检测不同棉花材料对棉蚜取食的影响基本吻合，从供试的10个棉花材料中可以反映出中棉12的抗蚜性最低.

综合分析上述3种蜜露检测法，均能很好地反映供试的棉花材料对棉蚜取食后蜜露代谢的影响，由此能较准确地筛选出具有抗蚜能力的材料.相比之下，比色法因其准确度高、稳定性好、简单方便和灵敏的特点而优于其他2种检测法.

3 结论与讨论

很多以刺吸植物韧皮部汁液为食的同翅目昆虫如蚜虫、飞虱、粉虱等以蜜露的方式将多余的养分如氨基酸和糖分排出体外，排蜜量的多少与其取食的寄主植物的抗生性密切相关，蜜露检测因而成为鉴定植物抗性水平的重要途径.蜜露的主要成分是糖和氨基酸，因此，国内外很多研究者多用溴甲酚蓝(绿)和茚三酮法进行检测，并以排蜜量减少的程度反映转基因作物对昆虫取食的影响.用溴甲酚绿显色法，NAGADHARA等［7］发现取食转 gna基因水稻的白背飞虱排泄的蜜露量减少了88%，与对照受体亲本相比，差异达极显著水平 (P＜0.01).同样，用茚三酮法也证实了芥蚜取食转wga基因的芥后，排泄的蜜露减少，这说明表达的WGA抑制了芥蚜的取食［4］.此外，将收集的蜜露通过蛋白印迹法还能检测出取食昆虫排泄的蜜露中是否含有外源凝集素.与取食未转化的亲本相比，只有取食转wga基因芥的芥蚜排泄的蜜露中才能检测出WGA，这说明该植物韧皮部汁液中确实有表达的WGA，进而也表明，有未经消化的WGA从芥蚜肠道排出［4］.蜜露成分分析主要是对蜜露中糖和游离氨基酸的定性和定量分析.杨益众等［8］研究了棉蚜取食2个转Bt基因棉和1个转Bt及CpTI基因棉后，发现蜜露的排泄与取食对照亲本相比分别减少22.67%，40.54% 和 30.0%，棉蚜取食转基因棉花后蜜露中游离氨基酸的总量均高于对照亲本，蜜露中可溶性总糖、蔗糖和各种氨基酸含量在取食转基因棉和常规棉花材料间存在一定差异.分析刺吸式口器昆虫取食转基因抗虫作物后的排蜜量及其营养成分的变化，可以探讨转基因作物对刺吸式昆虫取食和代谢的影响，从而成为鉴定和筛选转基因作物抗虫性的重要检测指标.

蜜露作为反映作物材料或转基因作物的抗蚜性指标已被广泛认可.纵观国内外采用的几种检测方法，作者进行了对比，发现蜜露色斑面积法、称量法和比色法均能反映各供试棉花材料的抗蚜性差异，所测结果反映的抗蚜性差异基本一致，说明这些方法均可以加以应用.但是，测量蜜露色斑面积时发现，即便面积相同，色斑却深浅不一，这说明含量的差异被忽略了.称量法则需达到天平的检测范围，这需要相对较长的接蚜时间或较大的蚜口密度.而比色法则无上述问题，操作既简便，又比较精确.而且，用该法还能反映棉蚜排蜜量与蚜口密度的关系，呈现明显的正相关性，相关系数达0.998 8，经与抗蚜性级别的转换，能推测出相应的抗蚜评价标准.探索出快速、准确、简易的蜜露检测方法将为转基因作物的抗虫性评估提供重要的签定依据.

［1］ 肖松华，刘剑光，吴巧娟，等.转外源凝集素基因棉花对棉蚜的抗性鉴定［J］.棉花学报，2005，17(2):72－78.

［2］ 张克斌，董家伦，翟延路.以14C标记棉花研究棉蚜取食、排泄、吸收与棉花材料抗蚜性关系［J］.原子能农业应用，1985(3):37－40.

［3］ 郭贵明，苏芝业，杨伦伦，等.麦长管蚜蜜露分泌量与小麦材料的关系研究初报［J］.山西大学学报:自然科学版，1993，16(2):228－231.

［4］ KANRAR S，VENKATESWARI J，KIRTI P B，et al.Transgenic Indian mustard(Brassica juncea)with resistance to the mustard aphid(Lipaphis erysimi Kalt.)［J］.Plant Cell Rep，2002，20:976 －981.

［5］ 刘光杰，沈君辉，寒川一成，等.水稻材料抗白背飞虱鉴定的定量指标［J］.植物保护学报，2003，30(2):153－160.

［6］ 刘树生.介绍一种饲养蚜虫的方法——新的叶子圆片法［J］.昆虫知识，1987，24(2):113－116.

［7］ NAGADHARA D，RAMESH S，PASALU I C，et al.Transgenic rice plants expressing the snowdrop lectin gene(gna)exhibit high-level resistance to the whitebacked planthopper(Sogatella furcifera)［J］.Theor Appl Genet，2004，109:1399 －1405.

［8］ 杨益众，陆宴辉，薛光杰，等.转基因棉花中糖类和游离氨基酸含量的变化对棉蚜泌蜜量及蜜露主要成分的影响［J］.昆虫学报，2005，48(4):491－497.