甘蔗花叶病毒侵染玉米后硫氧还蛋白M1，M3的表达谱变化

施 艳，孙 虎，孙炳剑，王振跃

(1.河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002;2.河南省农业科学院植物保护所，河南郑州450002)

甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)是马铃薯Y病毒属的成员之一，已有文献报道，通过抑制性消减杂交和基因芯片技术研究寄主对甘蔗花叶病毒的抗性［1］以及SCMV抗性基因的定位［2，3］.已有研究通过抑制性消减杂交技术研究了病毒侵染后玉米寄主基因的差异表达，并且克隆了其中一个病毒侵染后诱导表达的基因玉米硫氧还蛋白M2，发现玉米硫氧还蛋白 M2对 SCMV的侵染是起到抑制作用的.硫氧还蛋白是一类相对分子质量约为12 kD的小蛋白.所有的硫氧还蛋白都具有一个保守的活性中心，Trp-Cys-Gly(Ala)-Pro-Cys，活性中心中的这2个半胱氨酸起到氧化还原作用［4］.随着对植物中的硫氧还蛋白特别是拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的硫氧还蛋白研究的深入，硫氧还蛋白在植物中的许多重要作用也逐步显示出来［5～10］，在水稻中，通过转基因的方法敲除水稻硫氧还蛋白酶的表达，结果表明，水稻硫氧还蛋白酶在植物的生长和发育过程中有至关重要的作用［11］.拟南芥硫氧还蛋白m3(Trxm3)主要存在于非绿色组织的质体内，通过基因突变发现Trxm3与胞间连丝的调控有关，Trxm3突变的植株中胞间连丝的分支增多并且胼胝质的积累也加强［12］.为了成功建立侵染，病毒通过利用寄主因子来帮助它进行复制和移动.在病毒侵染的不同阶段，许多参与寄主新陈代谢、信号转导以及防卫反应的基因的表达谱会发生变化［13～15］，因此，研究病毒侵染后寄主差异表达的基因将有助于了解病毒的侵染机制.本研究采用实时荧光定量PCR方法研究了SCMV侵染后的不同阶段玉米硫氧还蛋白M1和M3表达水平的变化，分析玉米中不同硫氧还蛋白M与SCMV侵染的相关性，为进一步深入研究玉米硫氧还蛋白M的在抗病毒反应中的机制提供证据.

1 材料与方法

1.1 植物材料

以玉米(Zea mays L.)品种综31为试验材料.

1.2 病毒接种与叶片采集

在人工气候室种植玉米品种综31，待玉米长到三叶期选择长势好，生长状态一致的玉米幼苗分别接种对照0.01 mol·L-1磷酸缓冲液(phosphate buffer，PB)和甘蔗花叶病毒(SCMV)侵染的玉米汁液.

接种后 2，6，10，14 d，分别采取对照接种和SCMV接种的玉米的第1片系统叶，接种后8 d系统叶片上可以观察到花叶症状.

1.3 玉米的RNA提取与cDNA合成

利用 Trizol提取总 RNA，利用 TaKaRa的DNase进行总RNA处理，以质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，利用微量分光光度计Nanodrop检测RNA的含量和纯度.每个样品取0.5 μg总RNA进行第1链cDNA合成，方法参照Promega公司的M-MLV反转录酶使用说明进行.

1.4 实时荧光RT-PCR引物设计

根据已经发表的Trm序列，利用软件Primer Premier 5.0设计Real-time PCR的内参引物和目的片段引物，引物序列见表1.

1.5 实时荧光定量PCR反应体系

Real time PCR应用ABI 7500扩增仪的操作方法.按照 TAKARASYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)的方法操作，反应条件如下:94℃，30 s;94 ℃，5 s;58 ℃，20 s;72 ℃，35 s.40个循环.

1.6 数据分析

试验重复3次，采用Microsoft Excel处理数据，用SAS8.2软件进行统计分析，显著性测验在0.05水平进行.

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

2 结果与分析

2.1 玉米总RNA质量分析及cDNA第1链合成

利用Trizol提取总RNA，通过微量分光光度计Nanodrop检测RNA的浓度和纯度(表2).由表2可见，紫外吸光值A260/A280的比值均为1.8～2.0，表明提取的总RNA的纯度较高，采用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，可以发现RNA条带清晰，没有拖带现象，表明提取的总RNA的纯度和完整性较好，可以用于实时荧光定量PCR分析.

表2 玉米总RNA纯度和质量浓度Table 2 Purity and concentration of total RNAmg·L-1

图1 玉米总RNA琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Agrose gel analysis of total RNA in maize

2.2 实时荧光定量体系的建立

玉米硫氧还蛋白M1(ZmTrm1)在模板量为2.5 mg·L-1时，退火温度为58℃时扩增曲线的Ct值为22，介于15～30，表明有良好的扩增，融解曲线只有单一的融解峰，表明ZmTrm1是特异性扩增.玉米硫氧还蛋白 M3(ZmTrm3)在模板量为25 mg·L-1时，扩增曲线的Ct值为24，融解曲线显示单一的融解峰，表明ZmTrm3也是特异性扩增(图2).

图2 实时荧光定量PCR扩增的融解曲线Fig.2 Melting curve of real-time PCR

2.3 SCMV侵染后不同阶段ZmTrm1和ZmTrm3表达水平分析

通过实时荧光定量PCR分析ZmTrm1在SCMV接种后2，6，10和14 d的表达水平.从图3和图4可以看出，在接种后2，6和10 d，SCMV接种叶片与对照接种叶片ZmTrm1和ZmTrm3表达水平差异不显著，P值均 ＞0.05，在接种后 14 d，SCMV接种的叶片中的ZmTrm1和ZmTrm3表达水平显著下降.

3 讨论

硫氧还蛋白通过调控二硫键的氧化还原作用于一系列的靶标蛋白，从而影响植物的生长发育，已有报道表明，硫氧还蛋白参与了细胞内的维生素合成、蛋白折叠和转运、蛋白降解以及淀粉降解等过程［16～18］，此外，杨树中的叶绿体硫氧还蛋白 m调控的过氧化物氧化酶参与了病菌的防卫反应［19］.

实时荧光定量PCR已被广泛地应用于功能基因表达的定量分析［20］，本研究采用SYBR Green I随机掺入法是根据荧光染料与DNA双链结合后释放荧光的特点而建立的一种实时定量PCR技术，它的成本相对TaqMan探针法要低，而且不需要探针.由于SYBR Green结合DNA双链是非特异性结合，因此非特异性扩增可能会影响实验结果，本研究通过对扩增的融解曲线的分析可以发现，只有单一的融解峰，因此，本试验设计的引物保证了PCR扩增的特异性以及相对定量的可靠性.

ZmTrm1和ZmTrm3的表达水平在SCMV接种后2，6，10 d与对照没有显著差异，而在接种后14 d ZmTrm1和ZmTrm3的表达水平显著降低，两者受病毒调控表达水平的变化不同与ZmTrm2表达水平的变化.已有研究表明，ZmTrm2在接种后10 d显著上调表达，对 SCMV的侵染起到抑制作用［21］，而 ZmTrm1和 ZmTrm3 在接种后 10 d 表达水平没有显著变化，只是在SCMV侵染后期表达水平要显著下降，这可能是由于病毒侵染后期，叶片中叶绿体结构遭受破坏，光合作用变弱所引起的.硫氧还蛋白M是一种定位于叶绿体中，通过光调节碳代谢途径发挥作用，因此叶绿体结构的破坏可能会影响硫氧还蛋白M的表达.硫氧还蛋白是一类重要的氧化还原调节蛋白，不同的硫氧还蛋白M在病毒侵染的过程中发挥了不同的作用，本研究发现硫氧还蛋白M1和M3在SCMV侵染的后期表达水平显著降低，通过影响防卫反应途径的相关靶标蛋白发挥作用，从而间接地影响病毒侵染.

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