N-磷酰化多巴胺与牛胰岛素弱相互作用的ESI-MS研究*

韩国胜，冯 聪，王 珍，廖新成，武现丽

(郑州大学化学系∥河南省化学生物学与有机化学重点实验室，河南 郑州 450001)

神经传质物质多巴胺(DA)是由酪氨酸衍生而来，是继肾上腺素和去甲肾上腺素后第3种内源性儿茶酚胺，在体内为合成去甲肾上腺素的前体。不同剂量的多巴胺具有不同的药理特性，至今仍是治疗心力衰竭和休克的重要药物，被广泛应用于临床[1]。但多巴胺半衰期短、作用时间短，只能静注，应用范围受到一定的限制。近年来，对多巴胺副作用的报道逐渐增多：如最新的临床研究表明[2]，小剂量多巴胺(LDD)不仅对肾脏功能没有保护作用，而且对重症患者的内分泌、消化和呼吸系统都有不同程度的不良影响。因此，寻找体内半衰期长、生物利用度高、活性强和毒副性小的多巴胺类新型药物是一个重要的研究方向。对原有药物分子进行结构修饰是提高其各种性能的一种有效途径。磷酸酯常被用作前药来增加药物的水溶性进而提高它的生物利用率，因此对多巴胺进行磷酰化是改善其生物活性的一种方式，因为磷酸基团的引入可以改变其母体分子的某些物理和化学性质，增加或减弱分子间相互作用。在前期工作中合成了6种磷酰化多巴胺类化合物[3]，其结构见图1。

图1 6种N-磷酰化多巴胺的化学结构

药物小分子与蛋白质结合是药物在机体内的一种特殊的分布与储备形式，这种结合对于药物的作用强度与作用时间以及体内代谢与排泄过程都有重要影响[4]。目前，电喷雾离子肼-质谱(Electrospray Ionization-Mass Spectrometry, ESI-MS)以其在研究生理条件下蛋白与药物非共价结合所具有的分析速度快、灵敏度高及样品消耗量少等特点，已被成功地用于测定溶液中小分子物质与蛋白质间非共价结合的化学计量和解离常数[5-7]。

本文通过ESI-MS方式对所合成的6种N-磷酰化多巴胺分子与牛胰岛素的弱相互作用进行研究，比较了N-磷酰化多巴胺的不同结构对他们与蛋白相互作用的影响，初步探讨了其构效关系。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Bruker-Esquire-3000 电喷雾-离子阱多级质谱仪(Bruker Daltonics Gmbh, Germany)，检测范围m/z915～2 500；进样泵：Cole-Parmer 74900 syringe pump Cole Parmer 仪器公司。

1.2 主要材料与试剂

胰岛素购于Sigma化学试剂公司，未经进一步纯化直接使用；甲醇为色谱纯；醋酸为分析纯；水为纯水机(美国LABCONCO公司)生产的超纯水。

1.3 质谱条件

采用正离子检测模式，喷雾气(N2)压力82.76 kPa，干燥气(N2)流速7.5 L/min，毛细管电压4 000 V，毛细管温度200 ℃，样品导入离子源速率4 μL/min；混合溶液配制后，孵育一周进行质谱分析。

2 结果与讨论

2.1 磷酰化多巴胺与牛胰岛素的弱相互作用

牛胰岛素(Insulin from bovine pancreas，C254H377N65O75S6，相对分子质量为5 733.50)是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。它是一条由21个氨基酸组成的A链和另一条由30个氨基酸组成的B链，通过两对二硫链连结而成的一个双链两性蛋白质分子，而且A链本身还有一对二硫键组成，可以作为一种模型用于研究蛋白的空间构象、酶动力学以及分子进化、分子免疫间的关系[8]。近年来，关于溶菌酶与外源性分子相互作用的研究有些报道，陈晓岚等[9-10]曾通过ESI-MS和荧光光谱法对7-羟基黄酮、5,7-二羟基黄酮及其磷酰化产物与溶菌酶的相互作用进行过研究；其课题组还研究了柚皮素、柚皮苷、芹菜素、木犀草素、大豆苷元磷酰化衍生物、槲皮素、N-磷酰化肽酯及小肽、磷酰化多巴胺等与溶菌酶的相互作用[11-15]。而以双螺旋结构的牛胰岛素与外源性分子相互作用的研究却鲜见报道，本文通过研究N-磷酰化多巴胺与其相互作用来初步考察所合成小分子的生理活性。

因为机体pH值近中性，本实验选择近中性的溶液环境来研究N-磷酰化多巴胺与牛胰岛素的弱相互作用。作为对照，首先用ESI检测了流动注射的牛胰岛素溶液，此溶液由等体积的甲醇和0.04 mol/L胰岛素的φ=0.5%醋酸水溶液混合而成，图2显示了牛胰岛素从[M+3H]3+到[M+6H]6+的多电荷分布状态，并且以(M+4H)4+峰值最高。图2中所计算的平均相对分子质量为5 733，与事实相符。

图2 牛胰岛素ESI-MS图

蛋白质分子能够根据自身所处环境的微小变化，自发的进行分子构象转变是体现蛋白质生理活性的重要特征。蛋白质多电荷的特性为质核比大小、绝对电荷的多少、多电荷分布的相对丰度，都跟溶液中蛋白质的结构和构像有关。如果蛋白质的多电荷分布朝着低质核比和高电荷方向移动，这就和蛋白质更为“敞开”、“伸展”的构象相对应[16-17]。比较图 2和图 3中胰岛素的多电荷峰，可以看出各环境中胰岛素均以[M+4H]4+峰值为最高，但图 3中没有检测到[M+6H]6+峰，[M+5H]5+峰相对丰度也明显下降，[M+4H]4+峰强度占绝对优势，这表明蛋白质的多电荷分布朝着高核质比和低电荷方向移动了，说明加入化合物a,b,c,d,e,f后，胰岛素在溶液中的构象均趋于收缩。

比较图3的各个小图，可以看到随着磷上烷氧取代基链增长低电荷和高核质比的峰丰度增强，而高电荷低核质比的峰丰度减弱。化合物a、b、c和e相比磷上烷氧基的烷基取代基分别是碳原子数为1、2、3和4的直链烷基，比较它们的质谱图可以看到[M+5H]5+峰的相对强度逐渐减弱，而带4个电核的[M+4H]4+峰及其与底物形成的复合物峰的总强度是逐渐增加的，由此可以推断磷上的烷氧取代基上脂肪链越长胰岛素在溶液中的构象越趋于收缩。这可能是因为取代基增长分子的空间结构较为伸展，分子柔顺性和疏水性增加，使胰岛素分子在溶液中的构象更加收缩。化合物c和d相比，磷酰基上的烷氧取代基上脂肪链均是3个碳原子，c是丙基取代而d是异丙基取代，对比图3c和3d二者相差不大。再比较化合物e和f也可以得到同样的结论，说明当取代基的碳原子数相同时，支链或直链结构对胰岛素的空间构象影响程度差别不大。

从图3可以看到图中除了胰岛素的多电荷峰以外，出现了一些新的离子峰，它们分别对应于带不同电荷的胰岛素结合不同个数的N-磷酰化多巴胺所形成复合物。由图3a可知，所带电荷数为4和5的胰岛素分子容易和化合物a结合形成复合物，能够检测到化学计量数均为1∶1的复合物，说明胰岛素和化合物a能够发生弱相互作用。由图3b可以看到只有所带电荷为4的胰岛素分子能够与化合物b形成化学计量数为1∶1和1∶2的复合物。为了比较6种不同的底物与胰岛素所形成的复合物所带电荷数和计量比，将上述6种化合物与牛胰岛素形成的带不同电荷的复合物的不同化学计量比汇总于表1中。 表 1数据表明胰岛素和6种化合物最容易形成带4个正电荷的复合物，均没有出现带3和6个电荷的复合物， 也只有化合物a和f出现带5个电荷的复合物。这是因为这6种化合物也对胰岛素在溶液中构象有一定影响，当胰岛素溶液中加入这类化合物时胰岛素的[M+6H]6+峰消失，[M+5H]5+峰的强度大大减弱，其减弱程度与底物小分子结构有关。对比化合物c和d及e和f的结构，可以看到当取代基碳原子数相同时支链结构更容易与胰岛素形成高计量比的复合物；比较化合物a、b、c、e与胰岛素形成的复合物计量比可以看到当烷基取代基碳链越长时越容易形成高计量比的复合物。这可能因为碳链的长短及碳原子的排列顺序与分子的柔顺性和疏水性及空间位阻有关。从表1中可以看到复合物中底物与胰岛素的最高化学计量比为5∶1。

图3 牛胰岛素与6种化合物的混合溶液的ESI-MS图

表1 N-磷酰化多巴胺与胰岛素形成复合物的计量比及电荷数

2.2 N-磷酰化多巴胺与牛胰岛素复合物的稳定性研究

这些复合物是靠磷酰化多巴胺和牛胰岛素的弱相互作用形成的，在电喷雾离子阱质谱中它们具有一定的耐碰撞能力。当升高仪器的锥空电压(毛细管输出电压)时，带电粒子之间以及与溶剂分子、惰性气体分子之间的碰撞几率增大，因此有些复合物会发生解离，导致复合物的丰度降低。当锥空电压升高到一定值时，这些复合物就会消失，不同磷酰化多巴胺和胰岛素形成的复合物具有不同的耐碰撞能力，即复合物消失时(其信号强度在仪器信噪比3倍以下)，它们的最高锥空电压是不同的，据此可以比较不同复合物的相对稳定性[13,16,18]。 测定各种磷酰化多巴胺与复合物的最高锥空电压如表2所示。

表2 N-磷酰化多巴胺与胰岛素形成复合物的最高耐受电压

从表 2数据可以看出，磷酰化多巴胺上磷上烷氧基的烷基碳链越长，最高锥空电压越高；比较化合物a、b、c和e与胰岛素形成的复合物的分解电压，可以看到磷原子上烷氧取代基的直链烷基每增加一个碳原子最高锥空电压增加3～9 V左右，说明直链取代基的增长有利于增强底物与胰岛素之间的相互作用力，这可能是因为取代基越长分子的柔性越强，分子越容易变形，越有利于二者的相互作用。比较化合物c和d、e和f与胰岛素形成的复合物的最高分解电压可以看到，当取代基上碳原子数相等时，支链取代产物与直链取代产物与胰岛素形成的复合物相比，其最高锥空电压要低10 V多，这可能是因为支链取代时分子的空间位阻大，不利于二者的有效结合，减弱了其结合力。

3 结 论

上述系列N-磷酰化多巴胺均可与牛胰岛素在质谱条件下形成复合物，不同结构的磷酰化多巴胺与胰岛素形成复合物的个数、电荷分布和稳定性不同，而且对蛋白质在溶液中的构象有不同影响。磷上烷氧基中脂肪链的长短和碳原子排列顺序是主要影响因素。碳链越长越容易形成高计量比的复合物，胰岛素在溶液中的收缩程度越高；碳链越长小分子与胰岛素形成的复合物越稳定；但当碳原子数相同时因支链取代基的位阻增大而消弱了底物与蛋白质之间的相互作用。本结论为新型多巴胺类药物分子的设计和开发具有一定的理论指导意义。

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