花鳗鲡重组促黄体生成素在毕赤酵母中的表达*

毛黎敏，张 勇，李阳源，黄 海，李 波，李文笙，陈国华，林浩然

(1．海南大学海洋学院暨热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口570228；2．中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室∥中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东 广州 510275)

花鳗鲡Anguillamarmorata属于鳗鲡目Anguilliformes、鳗鲡科Anguillidae、鳗鲡属Anguillia，在我国主要分布于海南、福建、广东、浙江沿海江河，是我国鱼类中名贵的经济鱼类之一。近年来，由于过度捕捞、环境污染、拦河建坝等原因，导致花鳗鲡的自然资源剧减，我国已将其列为二级保护动物。目前，海南、广东等地积极发展花鳗鲡人工养殖业，市场前景广阔，产业发展势头良好。然而，鳗鲡人工繁育技术至今尚未解决。花鳗鲡的苗种完全依赖对天然苗种的捕捞，这不仅严重影响了养鳗产业的健康持续发展，而且对天然鳗鲡资源的保护与合理利用造成威胁。因此，开展花鳗鲡人工繁育研究迫在眉睫。

鱼类的生殖活动受到脑-脑垂体-性腺轴调控。下丘脑分泌促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)刺激脑垂体促性腺激素(Gonadotropin Hormone,GTH)的合成与释放。促性腺激素与其受体相结合后，诱导性腺细胞产生性类固醇激素，促进性腺的发育与成熟。脊椎动物具有两种GTH：促滤泡刺激激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)和促黄体生成激素(Luteinizing Hormone,LH)。它们是由异源二聚体组成的糖蛋白激素，由共同的α亚基通过非共价键与特异的β亚基相连，即促黄体激素(LH)由GtHα与LHβ组成，促卵泡激素(FSH)由GTHα与FSHβ组成[1]。对日本鳗鲡Anguilla.japonica的研究表明：FSH能诱导未成熟雄性日本鳗鲡雄激素增加，促进精巢发育[2-3]；LH能促进卵母细胞发育成熟[4]。因此，我们拟采用基因重组表达的花鳗鲡促性腺激素来诱导花鳗鲡性腺发育成熟。在克隆出花鳗鲡促性腺激素基因cDNA的基础上，建立高效表达花鳗鲡促黄体生成激素(LH)的真核表达系统体系，表达出有生物活性的促性腺激素，以期用于花鳗鲡人工诱导花鳗鲡性腺发育成熟等基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及载体 DH5α感受态细胞、毕赤酵母表达载体pPICZαA、野生型毕赤酵母菌株X-33均为本实验室保存。

1.1.2 主要药品与试剂 限制性内切酶XbaI、EcoRI、DraI,Blend Taq酶购自TOYOBO公司；Pfx高保真性酶购自invitrogen公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；Peptone,Yeast Extract为Oxioid LTR.Co.td 产品、YNB为Difco(USA)产品；抗生素Zeocin 购自Invitrogen公司； His-Tag、羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的二抗为博士德生物工程有限公司(武汉)产品；PCR引物合成和DNA测序由上海英骏生物技术有限公司完成，其余化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3培养基 大肠杆菌培养用LB低盐培养基(zeocin终质量浓度为0.25 μg/mL)，酵母培养采用YPD、YPDS(zeocin抗生素质量浓度分别为100，200，500 μg/mL)、BMGY、BMMY培养基，配方见invitrogen公司的酵母表达手册。

1.2 方法

1.2.1GTHα和LHβ基因片段的扩增 根据本实验室所克隆出的GTHα(GenBank序列号：FJ490345)、LHβ(GenBank序列号：FJ490347)分别设计引物PG1、PG2、PL1、PL2(表1)， 以花鳗鲡脑垂体cDNA为模板，分别扩增基因片段GTHα、LHβ。所扩增的片段GTHα、LHβ分别经胶回收、与pGEM-T载体连接、转化入感受态DH5α细胞中，分别挑取3个阳性克隆进行DNA序列测定。测序正确的阳性质粒分别命名为T-GTHα、T-LHβ。

1.2.2 pPICZaA-LHβα重组表达质粒的构建与鉴定 据所测质粒T-GTHα、T-LHβ的序列设计引物PG3、PG4、PL3、PL4， PG3引入EcoRI酶切位点；PL4引入XbaΙ酶切位点；PG4、PL3均引入linker(Gly-Ser)×3(引物序列见表1)。第一轮PCR以T-GTHα、T-LHβ质粒为模板，引物分别用PG3、PG4，PL3、PL4进行PCR扩增，扩增的酶用invitrogen公司的Pfx高保真酶，并回收产物；第二轮PCR则以第一轮的产物当作第二轮的模板和引物，扩增的酶用TOYOBO公司的Blend Taq酶，进行扩增，回收所需目的大小的条带。6His标签和终止密码子均为载体上自带。

将目的片段与空载体pPICZαA均用EcoRI、XbaI进行双酶切、胶回收，再将酶切回收产物连接、转化到DH5α感受态细胞中(构建示意图见图1)。小量提取质粒进行PCR与双酶切鉴定，分别选取3个阳性克隆进行DNA序列测定。序列正确的阳性共表达质粒命名为pPICZαA-LHβα。

1.2.3 电转入酵母菌株中 根据分子克隆实验指南大量制备和提取质粒 pPICZαA-LHβα，并测定pPICZαA-LHβα的浓度。将质粒 pPICZαA-LHβα用限制性内切酶DraΙ 进行线性化、胶回收。

表1 克隆所用引物序列

图1 pPICZaA-LHβa载体构建示意图

将所线性化的约10 μg共表达质粒 pPICZαA-LHβα电转化到毕赤酵母菌株X-33中，并涂布于YPDS平板上(YPDS平板中zeocin抗生素的质量浓度分别为100，200，500 μg/mL)，筛选生长表型，该菌命名为pPICZαA-LHβα-X33。

1.2.4 重组菌的发酵 在高抗生素的YPDS平板上挑取阳性克隆4个，接种于BMGY培养液中，28 ℃培养过夜，直至A600达到2～6时，离心、去除上清，沉淀加5 mL BMMY溶解，甲醇的终体积分数为0.7％。分别在24，48，72，96 h取样并补加甲醇，维持甲醇终体积分数为0.7％，于28 ℃下诱导表达。同时，做两个阴性对照，一个挑取YPDS平板上的pPICZαA-LHβα阳性克隆，进行培养，但不加甲醇诱导；另一个对照为空载体pPICZαA，进行培养，同时甲醇诱导体积分数为0.7％。每次所取的样参照TCA蛋白沉淀法沉淀蛋白后，用SDS-PAGE和western blot检测上清中的表达产物。Western blot 检测时，His-Tag 作为一抗，浓度为1∶2 000，室温、摇床上孵育2 h；二抗用羊抗鼠辣根过氧化物酶作标记，浓度为1∶2 000，室温摇床上孵育1 h，ECL显色。

2 结 果

2.1 LHβ、GTHα片段的扩增

琼脂糖凝胶电泳显示，产物GTHα大小296 bp、LHβ大小为348 bp，回收后与pGEM-T载体重组，重组质粒经DNA序列分析证实：扩增片段均与预期结果一致。

2.2 pPICZaA-LHβα重组表达质粒的鉴定

基因片段GTHα、LHβ经搭桥连接成单一片段LHβα成功，其片段大小约为700 bp(见图2)。重组质粒 pPICZαA-LHβα分别经EcoRI、XbaI双酶切鉴定、DNA序列分析与预期结果相符，氨基酸序列没有移码突变。

图2 LHβα基因片段验证图

2.3 表达菌株的阳性筛选

pPICZαA-LHβα重组质粒电转化入X-33酵母菌株，并涂布在含有高抗生素Zeocin的YPDS平板上，结果在质量浓度100 μg/mL上约生长出150～200个单菌落、200 g/mL上约生长出40～60个单菌落，而500 μg/mL的平板上则没有菌落生长。所以在200 μg/mL的平板上挑取阳性菌。

2.4 SDS-PAGE分析和Western blot 检测目的蛋白

将所摇菌的4个样分别进行SDS-PAGE电泳和western blot 检测，结果LHβα重组蛋白表达量以96 h最高，大小约为45 000，抗生素质量浓度为200 μg/mL，甲醇终体积分数为0.7％，PH6.0(图3)。

图3 LHβα 表达蛋白检测图

3 讨 论

在鱼类中，对促性腺激素的结构与功能的联系研究较少[5]。主要是因为很难获得足够量的GTHs。其次，LH和FSH具有很多相似的化学性质，所以要分离纯化天然的LH和FSH很困难。而重组蛋白的表达则能较好的解决这一问题，同时重组蛋白的获得对于抗体的制备、三级结构的研究以及进一步研究蛋白的功能等都具有非常重要的意义[6]。促性腺激素是由异源二聚体组成的糖蛋白激素，亚基的分离会影响异源二聚体蛋白的生物活性[5]。同时，促性腺激素α亚基的C-末端和β亚基的N-末端的所形成的区域利于其与促性腺激素受体结合[7-8]；而α亚基的N-末端和β亚基的C-末端则不能促进其与受体的结合和信号转导[9-10]。所以，本文将LHβ亚基与GTHα连接成一个共表达基因LHβα，N-末端为β亚基，C-末端为α亚基(见图1)。

本研究在LHβ与GTHα亚基之间，引入了含六个氨基酸的linker，即(Gly-Ser)×3。人绒毛膜促性腺激素(hCG)已经在毕赤酵母中成功表达[11-12]。在hCG中，β亚基的C-末端的最后30个氨基酸包含有C-末端肽(CPT)，它起到一个linker的作用，在异源二聚体的连接上起到至关重要的作用[13]。在内源性的促卵泡激素二聚体蛋白中，只有当FSHβ的C末端或GTHα的N末端含有CPT时，才能进行正常的合成、分泌、信号转导[9,10,13]。花鳗鲡LH缺乏CPT或者CPT类似结构，所以LHβα之间引入(Gly-Ser)×3 的linker。而Gly-Ser重复序列是带负电荷的、具有强亲水性，在β与α亚基之间能够提供足够的空间供亚基的折叠，形成与内源蛋白结构相近的、并能与其受体结合。两基因间引入linker的方法在其他共表达基因中也常用到，如ΙL-3和GM-CSF[14]、特异型抗体与GM-CSF[15]等。

在对日本鳗鲡的研究表明脑垂体合成与分泌的促性腺激素(GTH)在性腺发育成熟中发挥主要作用。在养殖条件下，鳗鲡由于缺乏适合的生态环境，促性腺释放激素和促性腺激素未能充分分泌和发挥作用，使得性腺发育成熟、排卵、排精等生理过程无法完成。注射鱼类脑垂体或hCG已经被成功用于诱导日本鳗鲡和欧洲鳗鲡的性腺发育成熟和产卵，但结果还不理想，存在亲鳗对激素反应慢、诱导性腺发育成熟效应差，成熟率、受精率和存活率低，仔鱼不能正常发育等问题[16-18]。这可能和这些异源促性腺激素不能完全代替同源促性腺激素的生理作用，造成性腺发育与成熟异常有关。近年来，许多鱼类的促性腺激素基因重组已在几种表达体系中成功表达，如大马哈鱼的LH在大肠杆菌中表达[19]；非洲鲶鱼的FSH和LH在变形虫表达[20]；日本鳗鲡的FSH[4]和罗非鱼的LH[21]在酵母中表达；鲤鱼的GTH-α亚基[22]、鲶鱼FSH和LH[23]在昆虫细胞中表达；斑纹鲈的FSH和LH[24]、东北鲑鱼LH[25]在哺乳动物细胞中表达；金鱼的FSH、LH在虹鳟胚胎细胞与家蚕幼虫中表达[26]；斜带石斑鱼的FSH和LH[27]在杆状病毒-昆虫细胞中表达，并研究发现重组促性腺激素，可以刺激石斑鱼性类固醇激素的分泌，进而促进性腺发育与成熟。因此，获得重组促性腺激素，以诱导鳗鱼性腺发育成熟与产卵是解决鳗鲡人工繁殖的关键之一。

然而，不管是昆虫表达还是哺乳动物表达体系表达重组蛋白，存在耗费大、实验操作难、很难大规模的扩大培养，不利于纯化。而用甲醇诱导的酵母表达系统表达重组蛋白，不需要耗费特殊昂贵的仪器、操作简便、同时能够大规模的发酵培养。其次，毕赤酵母表达系统具有很强的蛋白质修饰功能，如二硫键的形成、糖链的加工，对重组表达蛋白的N端进行糖基化。N-连接糖基位点在GTH的功能活性非常重要，特别是在糖蛋白激素与受体结合后激活G蛋白和刺激二级信号方面特别重要[28]。再次，毕赤酵母表达系统将外源基因表达的蛋白分泌到细胞外，从而利于表达产物的分离纯化。而外源蛋白需要分泌到细胞外，则需要在选择添加前导肽。当产物浓度高可能会引发一些自身的调节抑制表达[29]，同时胞外分泌表达也可以减少下游的纯化工序。但胞外表达是需要在载体中使用信号肽，而毕赤酵母的表达载体中不仅含有强启动子-乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,能够严格调控外源基因的表达，同时AOX1启动子与多克隆位点之间含有一段α信号肽，所以表达外源基因时可以不需要另外添加信号肽，直接添加编码成熟肽的碱基序列，从而使表达系统更加简单、高效。

所以本研究选用毕赤酵母表达系统表达重组花鳗鲡促黄体激素，且已经成功表达，将可以进行下一步功能、抗体等方面的研究，不仅充实花鳗鲡生殖内分泌学，而且可为花鳗鲡及其他鳗鲡人工繁育打下坚实基础。

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