基于细胞性质分析不同有机溶剂对简单节杆菌C1,2脱氢反应的影响

骆健美,宋 妍,王建锋,宁 静,成永新,郑 宇,申雁冰

(工业发酵微生物教育部重点实验室(天津科技大学) 天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

微生物的C1,2位脱氢反应是工业生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一类反应，也是工业上采用发酵法生产甾体药物的典型代表。甾体药物母核C1,2位引入双键后，能成倍地提高抗炎和抗过敏活性，副作用也更小[1，2]。在众多具有C1,2位脱氢能力的微生物中，简单节杆菌(Arthrobactersimplex)以专一性高、反应速度快等优点成为研究和应用较广泛的菌株[3，4]。甾体化合物的生物转化反应中底物的难溶性是限制转化反应效率的重要瓶颈[5]。目前，工业上主要通过加入有机溶剂提高底物的溶解度，其中，甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)的应用最为广泛[6～10]。

研究者大多将有机溶剂加入后转化反应效率的提高归结为底物的增溶作用。但事实上，添加有机溶剂后转化反应中微生物的各种生理性质都会发生变化，进而对转化反应产生影响。骆健美等[11]研究发现，不同浓度乙醇对甾体C1,2脱氢反应菌种——简单节杆菌的结构、生长和生理代谢产生影响。乙醇浓度的增大使得微生物的代谢活力和跨膜电位下降、细胞膜通透性增强，当乙醇浓度为8％时，细胞完整性明显被破坏。

作者以简单节杆菌TCCC 11037催化醋酸可的松(CA)的C1,2脱氢反应为模型，通过分析4种有机溶剂甲醇、乙醇、DMSO和DMF加入后微生物的细胞存活率、生理代谢活力、细胞膜通透性及细胞完整性的变化，探讨不同有机溶剂下转化反应效率产生差异的原因，拟为今后从细胞学特性方面加以改善，以进一步建立提高有机介质微生物转化反应效率的新方法提供理论指导。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株

简单节杆菌(Arthrobactersimplex)TCCC 11037，天津科技大学生物工程学院微生物制药研究室保存。

1.1.2 主要试剂及仪器

醋酸可的松(CA)及醋酸泼尼松(PA)标准品，天津市药检所；其它试剂及药品均为市售分析纯。

JSPM-5200型原子力显微镜；F-5301PC型荧光分光光度计；SBA-90型生物传感仪；Agilent 1100 Series LC型高效液相色谱仪(G1314Pump，G1322ADEGASSER G1314VWD检测器，20 μL AN进样器，Hp ChemStation)。

1.1.3 培养基

斜面培养基、种子培养基和菌体培养基参照文献[12]配制。

1.2 方法

1.2.1 斜面培养

将接种的斜面培养基置于培养箱中30 ℃恒温培养1～2 d。

1.2.2 种子培养

从斜面挑取1环菌种，接种于装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在160 r·min-1、32 ℃下培养18 h。

1.2.3 二级培养

按5％(体积比)的接种量将上述种子培养液接种于装有30 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，在160 r·min-1、32 ℃下培养24 h。

1.2.4 醋酸可的松的生物转化

向培养体系中分别添加4％(体积分数，下同)的甲醇、乙醇、DMSO、DMF，然后干粉投料(投料比5％)，在160 r·min-1、32 ℃下进行醋酸可的松的转化，期间不断取样，测定转化率和初始转化速率并表征各种细胞性质。以不加有机溶剂的培养体系为对照。

1.2.4.1 转化率的测定

取500 μL转化培养液，加入到1 mL乙酸乙酯中终止转化反应。取适量有机相挥干后，加入1 mL流动相重新溶解，用0.45 μm有机膜过滤后进样20 μL，HPLC分析测定底物转化率。由于样品中只含有底物CA和产物PA，且两者在240 nm下响应面积非常接近，因此，可采用面积归一化法检测CA转化率。

HPLC条件：色谱柱为Kromasil 100-5SIL(250 mm×4.6 mm)；流动相为二氯甲烷-乙醚-甲醇(86∶12∶2，体积比)，0.5 μm微孔滤膜过滤；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长240 nm。

1.2.4.2 初始转化速率的测定

菌体在分别添加4％的甲醇、乙醇、DMSO、DMF 4种有机溶剂的培养体系中进行醋酸可的松的转化，并于10 min后取样测定底物初始转化速率。反应速率以单位时间单位转化液体积中底物转化量来表示，单位为mg·mL-1·min-1。

1.2.5 细胞存活率的测定

采用10倍逐级稀释的方法于固体培养基平板中进行活菌计数，32 ℃倒置培养2～3 d，统计每皿的菌落数(每个稀释度做3个平行)。

1.2.6 糖代谢活力保留值(R)的测定

向离心收集后的菌体细胞中加入10 g·L-1葡萄糖水溶液10 mL，160 r·min-1、32 ℃下处理8 h后，取1 mL样品，用生物传感仪测定葡萄糖浓度。

1.2.7 超显微结构观察

转化培养液离心，洗涤2次后，将细胞固定在2.5％的戊二醛溶液中置于4 ℃冰箱过夜，将细胞浓度调至相同的菌悬液小心滴于盖玻片上，待水分自然晾干，用原子力显微镜检测。成像在大气环境下进行，扫描模式为轻敲模式。所有图像均通过自动平滑和低通滤波处理以消除慢扫方向的低频噪音。

1.2.8 细胞膜通透性的测定

FDA是一种不带电荷的亲脂性分子，本身不发荧光，但进入细胞后可被胞内脂肪酶水解产生荧光素。因此，可以利用荧光光度计检测菌液荧光强度的大小表征细胞膜的通透性。

转化培养液离心，洗涤2次后，生理盐水重悬，并将其OD600值调至0.8，此时细胞浓度约为1×107个·mL-1。FDA(最大激发波长492 nm，发射波长513 nm)用丙酮新鲜配制成浓度为2 mg·mL-1的贮备液，按1×107个·mL-1细胞加25 μL，使细胞终浓度为25 μg·mL-1，37 ℃水浴保存2 min后，检测菌液荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 不同有机溶剂对简单节杆菌转化醋酸可的松的影响

考察不同有机溶剂下简单节杆菌转化醋酸可的松的最终转化率和初始转化速率，结果见图1、图2。

图1 不同有机溶剂下简单节杆菌生物转化醋酸可的松24 h的转化率

由图1可知，有机溶剂的加入有利于醋酸可的松的生物转化，其中，添加乙醇时的最终转化率最高，达到85.26％，其余由高到低依次为DMSO 80.215％、甲醇69.785％、DMF 67.217％。

图2 不同有机溶剂下简单节杆菌生物转化醋酸可的松的初始转化速率

由图2可知，4种有机溶剂中，DMSO加入后，醋酸可的松的初始转化速率最高，为2.089 mg·mL-1·min-1，其次为甲醇1.913 mg·mL-1·min-1，而乙醇和DMF加入后初始转化速率比较接近，均与对照组相差不大。

2.2 不同有机溶剂对菌体存活率的影响(图3)

图3 不同有机溶剂对简单节杆菌存活率的影响

菌体存活率反映不同有机溶剂对简单节杆菌的毒害作用。由图3可知，添加4种有机溶剂后，简单节杆菌的细胞存活率均有不同程度的降低，其中DMF加入后细胞存活率下降速度最快，24 h时细胞存活率仅为2.50％；甲醇和乙醇的影响较小，24 h时细胞存活率分别为32.29％和25.10％，远高于DMF和DMSO。4种有机溶剂对简单节杆菌的毒害作用由强到弱依次为DMF>DMSO>乙醇>甲醇。

2.3 不同有机溶剂对菌体糖代谢活力保留值的影响(图4)

图4 不同有机溶剂下简单节杆菌的糖代谢活力保留值

糖代谢活力保留值(R)表征有机溶剂对简单节杆菌生理代谢活力的影响。由图4可知，有机溶剂存在时，菌体的糖代谢活力均大幅度降低，其中DMF处理时的R值最小，仅为18.49％；而乙醇和甲醇处理时菌体仍能保持较好的生理活性，其糖代谢活力保留值分别为25.34％和24.07％。这和不同有机溶剂对菌体存活率的影响基本一致。说明细胞生理代谢活力的变化直接决定了微生物在有机溶剂下的存活能力。

2.4 不同有机溶剂对菌体超显微结构的影响(图5)

图5 不同有机溶剂加入时简单节杆菌的超显微结构

由图5可知，未经有机溶剂处理的简单节杆菌细胞形状较规则，多为短杆形，细胞膜光滑完整。有机溶剂处理后菌体的细胞完整性和表面形态受到一定程度影响。其中，4％DMSO处理后的细胞出现了一定程度的收缩，部分细胞表面出现凹陷；4％甲醇和4％乙醇处理后的细胞长径的收缩更加严重，能观察到胞浆流出；4％DMF处理后的细胞大小无明显改变，但个别细胞的形状出现不规则变化，部分细胞表面有小体产生。由此可知，甲醇和乙醇的处理使细胞的完整性受到的影响较大。

2.5 不同有机溶剂对菌体细胞膜通透性的影响(图6)

图6 不同有机溶剂对细胞膜通透性的影响

由图6可知，添加DMSO、DMF、甲醇、乙醇时细胞的荧光强度分别为对照组的108.297％、101.967％、116.366％、110.117％，这说明4种有机溶剂的加入都使细胞膜通透性增大。其中，甲醇和乙醇处理时细胞膜通透性增大较为明显，而DMF对细胞膜通透性的影响最小。进一步证实了细胞完整性的观察结果，说明4种有机溶剂中，甲醇和乙醇对细胞完整性和膜通透性的影响较为显著。

3 结论

乙醇、DMF、DMSO、甲醇等4种有机溶剂加入后，简单节杆菌生物转化醋酸可的松的C1,2脱氢反应过程的初始转化速率和最终转化率均有所提高。但不同有机溶剂下菌体的初始转化速率差异不大，而最终转化率存在明显差异。其中，转化率从高到低依次为乙醇>DMSO>甲醇>DMF。4种有机溶剂对简单节杆菌细胞存活率和代谢活力的影响趋势基本一致，其中DMF的影响最大，DMSO次之，乙醇和甲醇影响较小。4种有机溶剂中，甲醇对简单节杆菌细胞完整性的影响最大，乙醇次之，DMF和DMSO差别不明显；4种有机溶剂对简单节杆菌细胞膜通透性的影响大小依次为甲醇>乙醇>DMSO>DMF。通过上述细胞性质的分析，可以认为，4种不同有机溶剂加入时，细胞生理代谢活力和细胞膜通透性的差异是造成转化率水平不同的重要原因。其中，细胞膜通透性的增强有利于底物分子更容易进入细胞与生物酶接触，进而提高转化率。综合考虑，乙醇是较为适合的有机溶剂。

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