γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸盐的制备

王 鹏，詹长娟，杨军方，李大力

(南京理工大学环境与生物工程学院，江苏 南京 210094)

γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA) 是由谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的一种多肽大分子，应用于生物医药材料、化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料等领域[1～4]。目前，制备γ-PGA的方法有化学合成法、提取法、微生物发酵法，其中微生物发酵法较适合于工业化生产[5～7]。

S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)也称S-腺苷蛋氨酸，是人体内一种重要的生理活性物质，参与多种生化反应，如转甲基、转硫、转氨丙基等，是半胱氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽、辅酶A等重要物质的前体[8]，在治疗肝炎、肝功能紊乱、关节炎、抑郁症、心血管疾病以及抗衰老、防癌等方面发挥着重要作用，市场需求日益增大[8,9]。SAM在pH>5时易分解，与有机分子形成盐有利于提高SAM的稳定性[10～12]。

作者利用从纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto) NL365发酵液中提取纯化的γ-PGA，制备了γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸盐(γ-PGA-SAM)，以利用γ-PGA的空间位阻来提高SAM的稳定性，有利于SAM在临床上的应用。

1 实验

1.1 菌种与试剂

纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto) NL365、酿酒酵母均为自行保存。

丁二磺酸腺苷甲硫氨酸，Abbott S.P.A.公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

纳豆芽孢杆菌发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母粉8，谷氨酸钠60，NaCl 45，pH值7.0,于37 ℃、220 r·min-1摇床培养4 d。

酿酒酵母发酵培养基(g·L-1)：蔗糖40，NH4NO35，MgSO4·7H2O 0.4，ZnSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.2，CaCl20.3，K2HPO40.8，KH2PO40.8，酵母浸出物 3，L-甲硫氨酸4，pH值5.0，于30 ℃、150 r·min-1摇床培养24 h。

1.3 方法

1.3.1γ-PGA的提取与纯化[13，14]

将纳豆芽孢杆菌发酵液以10 000 r·min-1离心15 min除去菌体；在上清液中加入2 BV乙醇，用玻璃棒搅拌缠绕出γ-PGA；将γ-PGA粗品用去离子水重新溶解后，用1 mol·L-1硫酸调pH值为2，静置过夜至出现白色絮状沉淀；5000×g离心10 min，收集沉淀，用70％乙醇洗涤，冷冻干燥，即得纯化的γ-PGA。

1.3.2 酿酒酵母细胞SAM的提取及其硫酸盐的制备

将酿酒酵母发酵液以5000 r·min-1离心10 min，收集菌体；按150 μL·(g湿酵母)-1加入乙酸乙酯，剧烈搅拌30 min；加入18 mL 0.35 mol·L-1的硫酸，继续搅拌1.5 h；5000 r·min-1离心10 min，收集上清液。

将D155树脂预处理成H+型后装柱(1 cm×60 cm)，用5～8倍柱体积的去离子水洗涤。将上述收集的上清液pH值调至5.0，流速2 mL·min-1，上样量为1000 mL。用5倍柱体积的去离子水和0.1 mol·L-1乙酸依次洗脱杂质，得SAM；然后用0.35 mol·L-1硫酸以2 mL·min-1的流速洗脱，得到SAM硫酸盐。在此过程中用HD 21-2型紫外检测仪进行监测(A260)，收集主峰。

1.3.3γ-PGA-SAM的制备

将经离子交换纯化的γ-PGA冻干品用去离子水配成0.02 g·mL-1的溶液。用2 mol·L-1NaOH溶液调节SAM硫酸盐的pH值为4.0，按SAM与γ-PGA中谷氨酸残基摩尔比为1∶5的比例加入γ-PGA溶液，搅拌1～2 h后，12 000×g离心10 min，在上清中加入2 BV无水乙醇，低温(4 ℃)沉淀过夜。12 000×g离心10 min，收集沉淀物，用无水乙醇清洗沉淀，干燥，得到γ-PGA-SAM。

1.4 结构表征

1.4.1 高效液相色谱(HPLC)分析

将γ-PGA-SAM冻干品用一定体积的蒸馏水溶解，取1 mL加入2 BV 0.35 mol·L-1硫酸处理2 h，12 000×g离心10 min，取上清液用微孔滤膜过滤后，用LC-10AT型高效液相色谱仪(岛津)进行HPLC分析[9]。以经相同处理的丁二磺酸腺苷甲硫氨酸为标准品对照。

色谱条件：VP-ODS色谱柱(Shimadzu Corporation)，流动相为0.01 mol·L-1甲酸铵溶液(pH值4.0)，流速1 mL·min-1，检测波长254 nm。

1.4.2 核磁共振氢谱(1HNMR)分析

γ-PGA-SAM冻干品的氢谱采用预饱和技术压制水峰获得，由南京高聚物纳米复合材料工程技术中心完成。

2 结果与讨论

2.1 γ-PGA的提取与纯化结果

从纳豆芽孢杆菌发酵液中提取γ-PGA的收率为9.33 g·L-1。纯化的γ-PGA为白色粉状。SDS-PAGE电泳结果与文献[14]相同，平均分子量约为1×106。

2.2 SAM的提取结果

酵母细胞破壁处理后的上清液中除了含有SAM，还含有许多杂质。离子交换层析后杂质明显减少，分离效果较好，SAM收率为67.5％。

2.3 产物γ-PGA-SAM的表征

2.3.1 HPLC分析

γ-PGA-SAM样品经硫酸处理后进行HPLC分析，结果见图1。

图1 γ-PGA-SAM样品经硫酸处理后的HPLC图谱

HPLC分析发现，γ-PGA-SAM样品经硫酸处理后的峰形与标准对照品丁二磺酸腺苷甲硫氨酸的峰形(结果未显示)一致，说明在γ-PGA-SAM的制备过程中SAM没有被破坏。

2.3.21HNMR分析

对丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA样品以及γ-PGA-SAM样品进行1HNMR分析，结果见图2。

图2 丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA样品及γ-PGA-SAM样品的1HNMR图谱

由图2可以看出，丁二磺酸腺苷甲硫氨酸、γ-PGA样品以及γ-PGA-SAM样品的1HNMR图谱中箭头标注的A、B、C、D 4部分发生了明显的变化。丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子C处δ4.45、δ4.48归属于丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子核糖2、3、4位碳上质子的化学位移，γ-PGA样品C处δ4.29归属于γ-PGA分子α碳上质子的化学位移，γ-PGA-SAM样品C处的峰并不是两者的简单叠加，而是向高场发生了移动；丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子D处δ2.83归属于丁二磺酸腺苷甲硫氨酸分子中与硫相连的甲基上质子的化学位移，具有精细结构，γ-PGA样品在D处没有峰，而γ-PGA-SAM样品在D处则表现为一个宽分布，这是典型的高分子化的特征。

3 结论

高效液相色谱、核磁共振氢谱分析结果表明，用γ-聚谷氨酸与S-腺苷甲硫氨酸反应制得的产物并不是γ-聚谷氨酸与S-腺苷甲硫氨酸的简单混合，而是γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸盐。S-腺苷甲硫氨酸分子中嘌呤环上的氨基、氨基酸链上的氨基以及极性较强的锍基都带正电荷，可与聚阴离子γ-聚谷氨酸的羧基之间发生相互作用。制得的γ-聚谷氨酸腺苷甲硫氨酸盐对提高S-腺苷甲硫氨酸的稳定性具有重要意义。

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