大白菜游离小孢子培养和植株再生技术研究进展

董彦琪 肖艳 段风华 原让花 原连庄 吴涛 霍学文

摘要：综述了影响小孢子培养的主要因素，包括供试材料(基因型、外部环境及生理状况)、小孢子(发育时期和接种浓度)、培养基成分(基本培养基、蔗糖、生长调节剂和活性炭)、培养方式(低温预处理、高温预处理、振荡培养)等；阐述了影响小孢子植株再生的一些因素——胚状体发育阶段、小孢子胚在液体培养基中滞留时间、培养基水分含量、活性炭等；总结了小孢子植株继代与加代技术，并提出了在该领域存在和需要解决的问题，展望了其在研究和生产实践中的应用前景。

关键词：大白菜；游离小孢子培养；胚状体；培养基；植株再生；生长调节剂；活性炭

大白菜 [Brassica campestris ssp.pekinensis(Lour.)Olsson]是原产于我国的一种重要蔬菜作物，属于十字花科芸薹属芸薹种大白菜亚种。大白菜在我国秋、冬季蔬菜生产与供应中居主导地位，是我国栽培面积最大、产量最高的蔬菜作物。大白菜为异花授粉植物，杂种优势明显，目前杂交种亲本系的选育主要采用常规自交方法，此法所需年限较长，要育成纯合的可利用亲本需要5～7年。近年来常规育种的不足在实际工作中日渐明显，各国学者开始寻找育种的新途径和新方法。游离小孢子培养(isolatedmicrospore culture，IMC)技术是一种新兴的生物技术。它具有单细胞、单倍体和较高胚胎发生率及较高同步性等特点，通过这种途径可以迅速获得双单倍体(doubled haploid，DH)纯合植株，2-3年内便可获得基因型完全纯合的自交系，这就大大加快了育种进程。20世纪80年代末期，日本学者Sato等首次在大白菜春性早熟类型上培养得到小孢子胚和再生植株：90年代初期，我国学者率先在国内开展了大白菜小孢子培养。此后，国内外学者在小孢子胚影响因素和发生机制、小孢子植株再生和加倍机制及实践应用等方面做了大量的探索，并取得了许多重要研究进展，有必要进行综述和探讨。

1影响游离小孢子胚胎发生的因素

1.1供试材料对小孢子胚胎发生的影响

1.1.1基因型基因型是影响小孢子胚胎发生率的关键性因素。基因型对白菜小孢子胚胎发生能力的决定作用体现在2个方面：(1)基因型的反应范围。曹鸣庆等、栗根义等、蒋武生等等众多学者认为大白菜是具有较强游离小孢子胚胎发生能力的栽培植物种，能成胚的基因型分别为94.12％、92.31％和87.50％：徐艳辉等的试验结果相反，据其报道能成胚的基因型比率较低，为18.92％。(2)胚胎发生频率(产胚率)的差异。曹鸣庆等、栗根义等、蒋武生等、徐艳辉等、张凤兰等、方淑桂等、周英等、耿建峰等、胡齐赞等、张亚丽等、付文婷等认为不同基因型大白菜胚状体发生能力有明显差异：四倍体大白菜基因型对小孢子胚胎发生能力有显著影响。研究表明小孢子胚胎发生能力同其他遗传性状一样。是一种受基因调控的遗传特性，基因型是影响小孢子胚胎发生启动与否的内在因素。

小孢子胚胎的发生能力还与植株类型有一定的相关性。刘凡等报道叠抱类型大白菜产胚率高于合抱类型，早熟类型产胚率高于中、晚熟类型；方淑桂等㈣报道拧抱炮弹型品种不但比叠抱型品种胚诱导率高，且胚产量也高。

1.1.2生长环境供体植株生长的温度条件是影响小孢子培养的关键因子。一般从发育健壮的植株上取花蕾进行培养效果较好。现蕾开花期植株处于昼夜温度10～25℃条件下胚状体产量较高。日照长度对小孢子产胚量也有一定影响，长日照(14-18h)和低温(15～20℃)条件下植株胚状体发生数量及植株再生率高。方淑桂等研究表明，供体植株采蕾期的气温条件是小孢子胚胎发生的关键因素，采蕾前3d气温在14℃/24℃(夜/昼)最适宜小孢子发育。因此，在无人工气候室的情况下，小孢子培养工作尽量在春季(3-4月份)进行，以避开秋季日照短、温度高对小孢子培养不利的环境条件。

1.1.3 生理状况供体植株的花序龄对胚胎发生的影响不同。申书兴等研究表明。无论是二倍体品种还是四倍体品种，株龄对小孢子胚胎发生率影响显著，盛花期是小孢子培养的适宜时期。方淑桂等研究表明，盛花期的花蕾和供体植株营养状况良好，有利于胚胎发生及植株再生。轩正英等研究表明，株龄对胚诱导率有一定影响。盛花期和末花期产胚率最高。周英等研究表明盛花期出胚率高于初花期和末花期，张亚丽、王秀英等也得到了同样结果，王秀英等还进一步指出下午取蕾优于上午。

1.2小孢子发育时期及密度对胚状体形成的影响

1.2.1发育时期选择合适的花粉发育时期是提高诱导频率的重要因素。胚胎发生的激发启动，大致发生在单核中期至单核靠边期这一短暂的发育过程中。与二倍体植株相似，四倍体大白菜的小孢子发育时期对胚胎发生率也有显著影响。单核靠边期小孢子占多数时胚胎产量最高。所以，选取合适的花粉发育时期对胚状体的诱导非常重要。曹鸣庆等研究发现。蕾长与小孢子发育进程密切相关。CCll基因型大白菜花蕾长2.0-2.5mm时，处于单核中期的小孢子占41.7％，处于单核靠边期的小孢子占58.3％，此时产胚量最高。邹金美通过细胞学观察发现，当花蕾长2.0～3.0mm，花瓣与花药长度比为1/2～4/5时，50％-70％的小孢子处于单核靠边期，最适合进行花药和游离小孢子培养。花蕾大小还与栽培条件有关，如温室栽培的F₁，代材料，花蕾大小6～7mm时小孢子仍处于单核晚期，但生长在大田的植株合适花蕾仅2-4mm。因此，细胞学观察与植物学结合确定合适的取材是必要和切实可行的。

1.2.2接种浓度接种浓度是小孢子培养能否成功的一个至关重要的因素。过高和过低均不利于胚的发育。过高时，会消耗大量营养物质，并且释放许多有害物质，影响胚的发育；小孢子发育需要群体效应，过低同样不利于小孢子胚胎的生长发育。一般认为小孢子密度2×10⁴～4×10²个·mL^-1最合适，而最近的研究表明1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1最为合适。

1.3培养基成分对小孢子胚胎发生的影响

1.3.1基本培养基培养基是诱导胚胎发生的基础，其不仅影响小孢子细胞的分裂，而且对胚状体产生再生植株的过程也有深刻影响。栗根义等曾用改良的Lichter培养液。日本学者Sato等采用了大量元素减半的NLN(Nitsch and Nitsch)培养基，张凤兰等采用了BM培养基。近年来，绝大多数学者采用最适宜的NLN基本培养基，大大提高了培养效果。大白菜四倍体材料的小孢子培养也采用了NLN基本培养基。

1.3.2蔗糖小孢子培养过程中普遍采用蔗糖作为碳源，其不但提供能量还维持细胞的渗透压。蒋武生等在不加任何激素的试验中比较了不同蔗糖浓

度的NLN培养基的培养效果，结果表明蔗糖含量为13％时培养效果较好。也有人选择10％和17％蔗糖浓度，高浓度蔗糖可保持小孢子活力，而低浓度蔗糖能促进小孢子分裂及其进一步发育。

1.3.3外源激素外源激素对胚形成和植株再生的影响至今没有取得一致的结果。轩正英等研究表明，6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄基嘌呤)能明显促进胚状体的发生，质量浓度0.05mg·L^-1时胚产量最高；张亚丽等和付文婷等研究认为6-BA对胚状体的发生和发育有促进作用，适宜质量浓度为0.2mg·L^-1；韩阳等研究认为6-BA的最适宜质量浓度为0.4mg·L^-1。

徐艳辉等报道，BA(Benzylaminopurine，苄氨基腺嘌呤)对小孢子胚胎发生有一定的促进作用，最佳质量浓度为0.2mg·L^-1；但对难成胚的基因型作用不大。韩阳等研究认为，NAA(1-naphthlcetic acid，α-萘乙酸)质量浓度在0.10-1.00mg·L^-1时对大白菜小孢子胚的发生有抑制作用，且浓度越高，其抑制作用越大。另外，在四倍体大白菜小孢子培养中发现，BA在0.2mg·L^-1水平下，NAA为0～1.0mg·L^-1时小孢子胚都有较高的发生频率，但NAA高于2.0mg·L^-1时会出现抑制作用。在0.5mg·L^-1NAA水平下，BA为0.05～0.20mg·L^-1时小孢子产胚率高；BA超过0.40mg·L^-1时出现抑制作用。

蒋武生等[司研究表明0.5mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1NAA对小孢子胚胎发生具有抑制作用。韩阳等研究认为较低浓度的细胞分裂素能促进胚状体的发生，6-BA的作用大于ZT(zeatin，玉米素)，ZT的最适宜质量浓度为0.2Mg·L^-1；2,4-D(2,4-D butyl ester，2，4-D丁酯)对小孢子胚的形成有强烈的抑制作用。

1.3.4活性炭适量的活性炭可以加快离体培养进程，提高小孢子胚产量、子叶形胚率及胚状体发育的同步性，但活性炭浓度不尽一致。徐艳辉等同报道，0.01-0.02mg·mL^-1的活性炭可明显促进小孢子胚状体形成。申书兴等研究发现添加0.05-0.10mg·L^-1的活性炭对二倍体及四倍体大白菜小孢子胚生率和发育同步性均有明显促进作用。孙丹等研究表明。在培养基中添加0.10mg·mL^-1活性炭能增加大多数品种的胚产量。原因可能是适量活性炭吸附了小孢子胚所产生的有害物质。蒋武生等研究表明，0.50g·L^-1的活性炭有利于小孢子胚诱导和形成。刘凡等研究也发现，1.40mg·mL^-1活性炭质量浓度下。原来一些无胚状体形成的材料有胚形成。仅有较少胚状体形成的材料产生了较多胚状体；但个别材料无论如何也得不到胚或者只能得到1至数个不正常的胚。韩阳等研究发现，高浓度的活性炭对小孢子胚发生表现出抑制作用。

1.4培养方法对小孢子胚胎发生的影响

1.4.1低温(冷击)预处理培养前的花蕾低温预处理对小孢子胚胎发生有一定影响。Sato等报道冷击预处理花蕾能提高大白菜小孢子胚发生率。轩正英等研究表明，花序在4℃下处理1-2d时，小孢子诱导率可明显提高。路翠玲等研究也得到了同样结果，并发现未经低温处理或处理时间过长，其胚状体诱导率较低。耿建峰等研究表明低温处理0-5d范围内小孢子胚诱导率差异不大，超过5d则明显降低。

1.4.2高温(热激)预处理

当大白菜小孢子接种到培养基上时，需要高温来启动和诱导改变小孢子发育的定向过程。即从配子体发育过程转变为孢子体发育过程。栗根义等认为35℃高温预处理对大白菜游离小孢子胚状体诱导很重要，其作用机制可能是改变小孢子发育途径，阻止小孢子向成熟花粉粒方向发展，促进其沿胚胎发育途径发展，最后形成小孢子胚。

姜立荣等研究认为，35℃高温诱导下小孢子第1次细胞分裂方式多种多样，但对称分裂方式占优势。刘公社等应用FDA和DAPI荧光显微技术，观察了高温处理对小孢子培养的影响，研究表明，33℃高温预处理24h，然后转入25℃条件下培养。小孢子成活率虽在第1天急剧下降，但随后仍保持一定水平：膨胀后的小孢子多呈圆球形，以类似于胚胎细胞的对称分裂方式为主：小孢子经多次分裂形成紧密多细胞团，最终形成胚状体。李菲等研究表明小孢子主要发育途径为B途径，33℃高温预处理24h后单倍体小孢子体积膨大，染色体发生自然加倍，从而激发小孢子进入孢子体发育途径。

赵冰等研究表明33℃高温预处理24h，不同基因型材料出胚量存在明显差别，诱导效率越高的基因型对高温反应越敏感，出胚量也越多。蒋武生等研究发现，较易诱导的基因33℃高温处理24h的效果最好，对于难诱导的基因型处理48h后胚诱导率高。刘公社等咖研究认为小孢子培养的高温预处理时间因基因型而异，一般在24-48h有效：若以分裂频率为评价指标。小孢子接受高温处理的敏感期位于开始培养的12h内：若以胚胎发生为评价指标，敏感期位于开始培养的24h内。

1.4.3振荡培养游离小孢子培养靠固体和液体培养2种方式。一般液体培养基营养物质容易被小孢子吸收，但由于透气不良，会有褐色胚产生。申书兴等在小孢子培养14d后进行摇床培养(60r·min^-1震荡培养)7d，结果表明，摇床培养改善了培养基通气性，促进了原胚迅速发育成子叶形胚，促进子叶形胚率和胚状体发育的同步性及小孢子胚直接成苗。赵俊等报道80r·min^-1低频振荡极大地提高了出胚数量。

2影响小孢子胚植株再生的因素

2.1胚状体发育阶段

在早期的研究中小孢子植株成苗率很低。只有5％-10％。小孢子胚再生受基因型影响，再生能力强的基因型易形成小孢子植株，但同一基因型处于不同发育阶段的小孢子胚成苗率差异很大，子叶期胚具有迅速再生成苗的能力。鱼雷期胚则较难成苗，处于球形期和心形期的胚则发育停滞。曹鸣庆等研究表明心形期至鱼雷期的胚胎移植后半数以上发育为幼苗，其中5％～10％为白化苗。韩阳等研究发现成熟的子叶形胚成苗率可达20％，子叶已扩大的萌发胚成苗率更高，在90％以上；发育早期的胚较难成苗，尤其是心形胚和球形胚成苗率均为0。

2.2小孢子胚在液体培养基中滞留时间长短

成熟的小孢子胚在培养基中滞留时间长短对植

株再生影响甚大。刘凡等研究表明停留14d和21d的小孢子胚转移至MS₀培养56d时成苗率分别达到85％和81.6％。停留28d和35d时最终成苗率只有63.3％和42.7％，大大低于前两者。

2.3固体培养基中水分含量

增加琼脂含量降低培养基中的含水量，可提高胚状体再生植株率。韩阳等研究表明。小孢子胚成熟后需要较干燥的生长环境，及时将成熟的子叶期胚转入相对干燥的培养环境对植株再生有利。当培养基中琼脂含量是1.2％时，最有利于小孢子胚成苗，再生株率为50.5％。刘凡等以含琼脂1.2％的MS₀培养基处理的死胚数量最少，植株成苗率最高，达到85.8％。申书兴等在四倍体材料小孢子培养中发现，培养基水分状况与成苗率有关，适宜胚状体成苗的培养基是B5附加3％蔗糖和1.2％琼脂。蒋武生等报道，B5+0.2mg·L^-16-BA+3％蔗糖+1％琼脂有利于小孢子胚长成植株。

2.4活性炭

刘凡等研究发现经活性炭处理获得的胚状体在光照下转绿、萌发、成苗等方面。都不及未经活性炭处理获得的小孢子胚。原因可能在于活性炭的吸附作用无选择性，当超过适宜浓度后，在吸附培养基中有害物质的同时，也吸附了生长调节剂、铁盐、维生素等与胚生长和分化密切相关的必要物质。因此活性炭浓度不宜太高，否则会起负作用。韩阳等研究表明，添加活性炭比不含活性炭成苗率高20％～122.5％，其中200mg·L^-1活性炭最有利于小孢子胚的成苗。

3小孢子胚继代、生根和移栽

蒋武生等研究表明，小孢子胚可在B5+0.20mg·L^-16-BA+0.02mg·L^-1NAA继代培养基上每25～30d继代1次。再将高度为3-5cm的健壮苗转移到Ms+0.10mg·L^-1NAA生根培养基上形成完整植株，植株4～5片叶时。移入盛有园田土的营养钵中7d后生根，10～15d后成活，成活率可达95％。付文婷等也有近似报道，B5+0.20mg·L^-16-BA+0.02mg·L^-1NAA有利于小孢子胚发育成植株，1/2MS+0.1mg·L^-1NAA适宜小孢子植株生根。徐艳辉等研究表明，2个基因型的小孢子胚在MS+0.8％琼脂+3％蔗糖+0.1mg·L^-1KT(Kinetin，激动素)+0.5mg·L^-1BA上的成活率分别为82％和92.5％。继代培养后的小孢子植株在1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.1mg·L^-1NAA生根培养基上生根良好，已生根的小孢子植株移到1/2壤土+1/2粪土的盆中便可生长。张亚丽等研究表明，B5+0.1mg·L^-1GA³(GibberellinA₃，赤霉素)是小孢子胚芽分化的最佳培养基，1/2MS+0.1mg·L^-1NAA为小孢子植株最适宜生根培养基。周英等研究表明，MS+0.10mg·L^-1NAA为小孢子植株生根最适宜培养基，

赵岫云等研究表明，小孢子植株再生能力的遗传符合加性一显性模式。主要受核基因控制，基因作用以加性效应为主。植株再生能力由隐性基因控制，狭义遗传力为70.6％。这为改良小孢子植株再生能力差的材料提供了一条有意义的途径，可选用植株再生能力强的材料与之杂交，提高后代植株再生能力，从而获得更多的小孢子再生植株。

4小孢子植株加倍技术

由小孢子培养所得到的植株只有通过染色体加倍成为二倍体才能应用于育种实践。小孢子再生植株中出现DH植株的频率不完全相同，但总体趋势是频率较高。曹鸣庆等研究由小孢子培养产生的小孢子植株中自然加倍率在50％～70％。张凤兰等研究了春秋两季小孢子再生植株自然加倍率不等，多数品种在70％，还认为由该游离小孢子培养得到的再生植株无需人工加倍处理，有自然加倍成为二倍体的特点。这一研究结果为该技术在育种工作上的有效利用提供了广阔前景。李菲等研究表明，小孢子胚再生植株具有较高的自然加倍率，并且与热激诱导激发小孢子单核自然加倍为二倍体密切相关。如需人工加倍，主要用0.2～4.0mg·g^-1秋水仙碱处理单倍体植株。

5问题与展望

综上所述，游离小孢子培养这一具有重要理论意义和实践价值的生物技术越来越被科研工作者所重视，并得到广泛应用。但还存在着许多理论和实际问题，如在适宜条件下，大多数基因型可获得小孢子胚，但也有少数基因型不能获得小孢子胚及再生植株，这一领域所取得的进展尚未达到随意操作雄配子的程度，在启动机理、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的理论研究还十分欠缺。

利用该技术能够在较宽的基因型范围内以较高的胚状体发生率获得小孢子胚和再生植株，但远远没有达到建立起完善的、高频的再生体系的程度。小孢子植株具有自然加倍成为二倍体的特点，在遗传和g种研究方面具有十分诱人的应用前景，但关于小孢子胚自然加倍机制尚待进一步探讨。

今后应加强理论研究和实验技术两方面的工作，建立能稳定、高效地获得纯合二倍体的游离小孢子培养体系，使之与传统育种技术有机结合成为大白菜育种的一个重要组成部分。

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