TNF-α对体外培养的人牙囊细胞增殖特性及碱性磷酸酶的影响

毕迎春 李芸 金作林

[摘要]目的：检测不同浓度TNF- 对体外培养人牙囊细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响。方法：第5代人牙囊细胞接种于96孔培养板上，分别与不同浓度的TNF- 共同孵育，检测TNF-对人牙囊细胞的增殖活性和碱性磷酸酶活性的影响。结果：TNF-在浓度为10～50ng/ml，时间为3天时促进人牙囊细胞的增殖，浓度为10～200ng/ml时抑制碱性磷酸酶活性。结论：TNF-在特定的浓度和时间促进人牙囊细胞的增殖，抑制牙囊细胞的成骨特性。

[关键词]牙囊细胞；肿瘤坏死因子－α；增殖；碱性磷酸酶

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）01-0071-03

Effects of TNF-α on the proliferation and alkaline phosphatase of the human dental follicle cells

BI Ying-chun1,Li Yun2,JIN Zuo-lin3

（1.Department of Stomatology,General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese PLA,Jinan 250031,Shandong,China;2.Department of Stomatology,210 Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA；3.Department of Orthodontics,College of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China）

Abstract:ObjectiveTo study the effects of different concentration TNF-α on theactivity of proliferation and the activity of alkaline phosphatase of human dental follicle cells.MethodsThe 5th passage human dental follicle cells were seeded on 96-well plates and co-cultured with different concentration of TNF-α, the activity of proliferation and the activity of alkaline phosphatase was assayed.ResultsThe 10～50ng/ml TNF-α enhanced the activity of proliferation profoundly and the effects were significant at 3 days after co-culture. 10～200ng/ml TNF-α decreased the activity of alkaline phosphatase.ConclusionsTNF-α enhance the activity of proliferation and decreased the activity of alkaline phosphatase of human dental follicle cells at special concentration and time.

Key words:dental follicle cell; Tumor necrosis factor-α; proliferation; ALP activity

牙囊组织起源于外胚间充质，是包绕成釉器周围的疏松结缔组织，在牙齿萌出和牙周组织形成中起重要作用，缺乏牙囊的牙齿不能萌出，牙囊组织调节各种因子，如TNF-α、IL-10[1]、RANKLE等，吸引外周血中的单核细胞进入牙囊，融合成破骨细胞。TNF-α[2]第三天在大鼠牙囊中有微弱的表达，至第9天达到高峰，与第10天形成的破骨细胞高峰期有密切关系，TNF-α参与牙齿萌出的因子调节，是牙齿萌出过程中的重要因子。而TNF-α对人牙囊细胞的增殖的研究未见报道，这对TNF-α对人牙囊细胞生物学特性的影响有进一步的认识。

1材料和方法

1.1 主要试剂与仪器：DMEM高糖培养基(Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物材料有限公司)；胰蛋白酶(GIBCO公司，进口分装)；TNF-α(Peprotech公司，USA)；96孔细胞培养板(NUCO，USA)；噻唑蓝(MTT，Sigma，USA)；二甲基亚砜(DMSO，上海东风试剂厂)； 碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物试剂公司)；噻唑蓝(MTT，Sigma，USA)； CO2细胞培养箱(Forma Scientific 公司，USA)；YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)；DG-3022型酶联免疫仪(南京华东电子仪器厂)。

1.2 人牙囊细胞的体外培养：取12岁因正畸需要拔除的下颌第三磨牙的牙囊组织,用含双抗的PBS 液冲洗3遍,切成1mm×1mm×1mm的组织块,离心收集组织块,625U/ml胶原酶消化40min,离心900r/min×6min,收集细胞和碎组织块加入0.5ml含10%新生牛血清的高糖DMEM 培养液(含双抗),接种到6孔板上,37℃,5%CO2孵育,3h 后加入培养液,5天后更换,以后每3天换液一次。5～10天可见细胞从组织块爬出,15～20天待细胞长至80%,用0.25%胰酶消化传代,利用细胞对胰蛋白酶消化时间的不同,可排除上皮细胞的混杂,达到纯化牙囊细胞的目的,约传代2次即可纯化细胞。取3～6代细胞用于实验。

1.3 TNF-α对体外培养的HDFCs增殖的浓度效应：取第3～6 代人牙囊细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，配成单细胞悬液，以每孔1 000个细胞接种到96孔板上，每孔加5%FBS的DMEM 200μl，次日去除未贴壁死细胞，换含1% FBS 的DMEM培养液，同时分别加浓度为5、10、25、50、100、200ng/ml的TNF-α，对照组不加IL-1α，每组4 孔，第4天终止培养，每孔加MTT溶液20μl(5mg/ml)，37℃继续孵育4h，终止孵育，小心吸弃培养液，每孔加150μl DMSO，振荡10min、490nm 波长处酶联免疫仪上测各孔光吸收值，记录结果并进行方差分析。

1.4TNF-α对体外培养的HDFCs增殖的时间效应：按1.3的方法准备细胞，换含1% FBS 的DMEM 同时加空白对照组，实验组加入TNF-α10ng/ml分别在1、3、5、7天 终止培养，每组4孔，每孔加MTT溶液20μl(5 mg/ml)，37℃继续孵育4h，终止培养，吸弃培养液，每孔加150μl的DMSO，振荡10min，490nm 波长处酶联免疫仪上测各孔光吸收值，记录结果并进行t检验。

1.5 TNF-α对体外培养的HDFCs的ALP的影响： 取生长良好的第5代人牙囊细胞用2.5g/l 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/l FBS 的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔103细胞接种到96孔板上，每孔体积为200μl，次日去除未贴壁死细胞，换含10ml/l FBS 的DMEM培养液，加入TNF-α浓度分别为0、5、10、25、50、100、200ng/ml，每组8孔，每3天 换液一次。于加液后5天 终止培养，其中4孔用作MTT检测细胞增殖，另4孔用pH7.4的PBS洗3遍吸干，每孔加入1ml/L Triton X-100 50μl，置4℃冰箱过夜，然后加入碱性磷酸酶底物，每孔100μl，37℃孵箱内置30min，以0.2mol/L NaOH 50μl/孔，终止反应，在酶联免疫检测仪上在410nm波长处测各孔A值，计算ALP/MTT的比值(A410/A490)间接反映细胞碱性磷酸酶活性，采用单因素方差分析进行统计学处理。

1.6 统计学分析：所有计量资料均以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，与对照组之间差异比较P＜0.05有统计学意义。

2结果

2.1 TNF-α对体外培养的HDFCs增殖的浓度效应：TNF-α对牙囊细胞的增殖具有轻度促进作用，在10ng/ml时对牙囊细胞开始有促增殖作用，在50ng/ml时达到最高峰(P<0.05)，当浓度增大至100ng/ml时，对牙囊细胞的增殖无明显促进作用(P>0.05)(见表1)。

2.2 TNF-α对体外培养的HDFCs增殖的时间效应：选用10ng/ml的TNF-α，仅在第3天对牙囊细胞的增殖具有明显的促进作用(P<0.05)，在的5天和第7天促增值作用不明显，与对照组无明显差异(P>0.05)(见表2)

2.3TNF-α对体外培养的HDFCs的ALP的影响：见表3，可看出，TNF-α对体外培养的HDFCs的碱性磷酸酶的表达有抑制作用，在浓度大于10ng/ml时，与对照组(浓度为0ng/ml)有显著性差异(P<0.05)。

3讨论

细胞增殖是检测外界因素对细胞生物学效应的一个重要手段，它反映了细胞在受到外界环境因素作用后，自身发生变化的情况。TNF-α在牙齿萌出过程中具有重要作用，是调控牙齿发育和萌出的细胞因子，本实验中发现TNF-α在浓度为10～50ng/ml时具有促进HDFCs增殖的作用，在时间效应的实验中，10ng/ml的TNF-α在第三天时具有促进增殖的作用，随后5天、7天的作用并不明显，说明过高的因子浓度并不能引起相应的细胞增殖，也说明了细胞对某种因子的敏感浓度有一定的范围，超过这一范围，细胞将不敏感，甚至有毒副作用，引起细胞状态不佳甚至死亡。

TNF-α对人牙囊细胞的增殖的研究未见报道，但TNF-α在大鼠的牙囊组织中有表达[2]，且与牙齿萌出过程中的破骨细胞的形成有关，因而推测某种浓度范围内的TNF-α对牙囊细胞有促增殖作用，以往的研究也证实TNF-α可以促进成纤维细胞的增殖[3]，而牙囊细胞来源于外胚间充质，具有成纤维细胞的特性，二者的生物学特性有某些相似处。

碱性磷酸酶(ALP)是参与骨等硬组织形成、代谢、再生的重要调节物质，又是细胞分化成熟和成骨能力的标志之一， 碱性磷酸酶是与钙化组织形成密切相关的一种物质，是向成骨细胞和成牙骨质细胞分化的标志。碱性磷酸酶广泛分布于体内几乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通过水解磷酸酯、破坏矿化抑制剂及作为钙结合蛋白和磷酸基的转运子而促进矿化，作为生物矿化和成骨样细胞的特征性标记。它的表达代表骨形成状况，表明细胞分化的开始，并随细胞分化的发展而增强，其活性的高低可反映相应细胞向成骨方向转化的趋势。

本实验所采用的ALP活性检测法是利用ALP可催化对硝基苯磷酸盐水解为对硝基苯酚和磷酸盐，而产生可间接反应ALP活性的对硝基苯酚的量，与在410nm波长测得的A值呈正相关。

牙囊细胞源于外胚间充质，是具有多向分化潜能的细胞群，含有发育成牙周组织的前体细胞。Handa等[4]通过体外培养牛牙囊细胞并提取RNA进行RT-PCR检测，结果表明，细胞表达低水平的碱性磷酸酶。王浈等[5]在体外培养的人胚胎牙囊细胞中检测到碱性磷酸酶mRNA的低水平表达。张永宽[6]等用矿化液处理牙囊细胞后，ALP的活性增强，Zhao M等[7]的研究表明体外培养的永生化的鼠牙囊细胞在rhBMP-2诱导下可以向成骨细胞/成牙骨质细胞表型分化， rhBMP-2能增强骨钙蛋白、骨涎蛋白的表达，说明牙囊细胞具有向成骨样细胞分化的潜能。Morsczeck[8]等 用地塞米松和胰岛素诱导牙囊细胞向成骨样细胞分化，骨钙蛋白的表达增强，以上研究结果表明牙囊细胞具有一定的成骨特性。

TNF-α是一种炎症介质，在体内有多种生物学活性，包括诱生其它细胞因子，调节血管内皮细胞性能，诱导抗病毒活性、血管生成和成纤维细胞生长等，近年来，研究发现TNF-α能促进破骨细胞的分化，促进骨吸收[9]。在前面的文献回顾中我们提到TNF-α可抑制多种成骨因子的表达以及促进破骨因子的形成，ALP活性就是TNF-α抑制的因子之一。Nakase[10]等研究发现TNF-α可抑制成骨细胞中ALP的表达，并降低BMP-2、BMP-4引起的ALP的升高。Okabe[11]等研究发现TNF-α可降低牙髓细胞的ALP活性，并且这一作用通过NF- κB 和 Smad7信号途径进行的，这一过程可减少继发性牙本质的形成。本研究中TNF-α在大于10ng/ml时即可抑制ALP的活性(P<0.05)，说明TNF-α能抑制牙囊细胞的成骨特性，同时也说明牙囊细胞具有成骨和破骨两种特性，在不同因子的作用下，牙囊细胞可表现不同的特性，也表明在牙齿萌出、发育过程中，成骨和破骨的发生是由多种因子共同作用发生的，可能引起牙胚冠方的骨质吸收，根方的骨质增生。其时间、空间的分布是非常复杂的，也是我们需要进一步研究的方向。

4 结论

本实验采用不同浓度的TNF-α作用于体外培养的HDFCs，在浓度为10－50ng/ml可促进HDFCs的增殖，10ng/ml的TNF-α在第3天可促进HDFCs的增殖，说明TNF-α对HDFCs的促增殖作用存在最佳浓度和最佳时间。ALP活性的检测证明：TNF-α浓度>10ng/ml可降低ALP活性。

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[收稿日期]2011-08-13 [修回日期]2011-10-26

编辑/张惠娟