病毒基因沉默抑制因子与AGO蛋白结合抑制RNA沉默的研究进展

申永梅 杨纪君 霍晓辉 田东方 曹雪松

摘要：总结了RNA 沉默及病毒RNA 沉默抑制因子(VSRs)的研究进展，以及病毒基因沉默抑制因子利用甘氨酸/ 色氨酸(GW) 模型作为ARGONAUTE(AGO) 钩和寄主发生RNA 沉默的重要作用部位相互结合从而抑制基因沉默的研究机制。通过研究发现，在酵母、动植物细胞中，一些包含GW 模型的蛋白质被认为是RNA 沉默效应复合物中AGOs 的重要协助者。结果说明，GW 模型是一种能用于调节RNA 沉默途径活性的万能的、有效的工具，用GW 模型竞争性结合AGOs 并抑制寄主基因沉默可能是一种被许多病原菌用于抵抗寄主RNA 沉默的方法。

关键词： RNA 沉默； VSRs； AGO 蛋白； GW 模型

中图分类号： Q74 文献标志码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.01.006

Evolution of Restraining Host RNA Silencing by Binding of Viral Suppressor Protein and Argonautes

SHEN Yong-mei1, YANG Ji-jun1, HUO Xiao-hui1, TIAN Dong-fang2, CAO Xue-song1

（1.College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng, Shandong 252059, China;2. Shandong Provincial Committee School,Jinan ,Shandong 250103,China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ:This paper summed up the evolution of RNA silence and viral suppressors of RNA silencing (VSRs) ,and viral suppressors of RNA silencing use glycine/ tryptophane (GW) motifs as an ARGONAUTE (AGO) hook inhibit gene silence by binding the important location of RNA silence. Through the study we found that, in yeast, animal and plant cells, some protein containing GW motifs was considered to be important partners of AGOs in RNA silencing effector complexes.The result indicated the GW motif seemed to be a universal and effective tool for regulating the activities of RNA silencing way, and many pathogens may use the method of GW motif competing for and restraining host AGOs to counteract host RNAi-based defenses.

Key words: RNA silencing; VSRs; argonaute protein; GW motifes

RNA 沉默是广泛存在于真核生物中的调控基因表达的保守机制，其作用是调控多种生物学功能，包括维持基因组的完整性、发育过程中基因的调控、控制多种生理活性和对外界各种非生物及生物刺激的响应等，特别是抗病毒反应[1]。这一现象发现距今20 a，对其机制的研究到现在也仅10 a，可是它的出现揭示出生命另一种基因表达调控方式，改变了人们原本认为非编码RNA 在体内不起关键作用的看法，也迅速成为人们研究的热点。随着2006 年诺贝尔奖正式授予这一领域的研究成果，该领域的进展更是日新月异。通过对RNA 沉默机制的研究，人们发现了由不同小RNA 介导的RNA 沉默途径，并鉴定了一系列参与RNA 沉默途径的关键蛋白。其中， RISC 核心成分AGO 蛋白( argonaute proteins) 日益成为人们研究的焦点。AGO 蛋白是RNA 沉默路径中的一个关键蛋白，它与小RNA 的引导链及其他蛋白组装成RISC ，在植物中共同参与维持基因组的稳定、调控组织发育、对逆境的适应性应答以及在RNA 层面对入侵核酸(转基因和植物病毒) 的免疫。近来的研究发现了另一类与AGO 蛋白结合并在基因沉默中发挥作用的蛋白，这类蛋白序列中含有重复的甘氨酸、色氨酸(GW/WG repeats or GW motif)，广泛存在于酵母、植物和动物细胞中，序列中GW/WG 重复2次至多次，并且是与AGO 相互作用的关键氨基酸，因而称为“AGO 钩”(Ago hook)。蛋白质序列中GW/WG 重复可能是与AGO 蛋白相互作用的进化保守序列及关键结构域，能用于调节活动的RNA 沉默途径，用GW 模型竞争和抑制寄主AGOs 可能是一种被许多病原菌用于抵抗寄主RNA 沉默的方法。

1病毒利用病毒RNA 沉默抑制因子（VSRs） 抵抗寄主以RNA沉默为基础的抗病毒能力

真核生物在长期进化过程中获得了“分子免疫的预警系统”，能够检测到细胞中的双链RNA(dsRNA) ，dsRNA是引起RNA沉默的“激发分子”，dsRNA可来源于病毒基因组的复制中间体、真核生物体内miRNA基因转录产物的自我配对以及人为引入反向互补DNA的转录本等。dsRNA产生后，RNA酶III类(RNase III) 的Dicer酶(植物中称为类似DICER，DICER-LIKE，DCL) 识别并结合到dsRNA 上，并切割dsRNA 成21~24 nt 的小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA) 。初始siRNA 产生后经宿主的“依赖于RNA的RNA聚合酶(RDR)”扩增并被DICER 切割产生大量次级siRNA，并可作为系统RNA 沉默信号，经植物的胞间联丝和韧皮部传播到其他组织和细胞，引起系统RNA 沉默，为抵消这种寄主防御方式，病毒产生蛋白质来抑制RNA 沉默[2] 。

已经发现，几乎所有的植物病毒属和一些动物病毒中都有VSRs 。它们的序列极其多样，并含有ORFs 或与其他保守病毒基因交叉重叠。我们已经知道50多种VSRs，除了在病毒的复制、折叠、运动、发病机理过程中起重要的作用之外还能抑制寄主以RNA 沉默为基础的基因沉默[3] 。尽管 VSRs抑制RNA 沉默的作用机制呈现多样性，即作用于RNA 沉默路径中的靶位点不同，但其作用方式基本上可以分为2种类型。一种是通过和dsRNA 结合防止了小RNA 和AGO 蛋白结合产生RISC ，减少或抑制siRNA 的产生从而抑制RNA 沉默。这些结合dsRNA 的VSRs有着不同的序列和结构。研究得最清楚的例子是来自植物番茄丛矮病毒的P19蛋白，P19和芜箐花叶病毒(TuMV) 的P1/HC-Pro 蛋白具有阻断HEN1 对小RNA 的甲基化作用，导致siRNA 因缺少末端甲基化保护而易于降解[4-5] 。黄瓜花叶病毒(CMV) 编码的2b 蛋白及花椰菜花叶病毒(CaMV) 编码的P6蛋白是通过直接或间接干扰DCL而抑制RNA沉默 [6-7]。然而P19 和2b 蛋白代表的是一类结合小RNA具有特定长度的病毒RNA 沉默抑制因子，一些其他病毒RNA 沉默抑制因子，如来自植物线性病毒组的P21 蛋白[5] 及来自昆虫Flockhouse 病毒 (FHV) 的B2[ 8-9] 能单独结合dsRNAs从而抑制基因沉默。

另一个作用机制是通过和RNA 沉默途径中的某些蛋白相互作用来抑制RNA 沉默。作为一个已知的RNA 沉默过程中的结合蛋白，AGO 很容易成为基因沉默抑制因子的作用目标。已有报道，黄瓜花叶病毒(CMV) 的2b 蛋白可以和AGO1 的PAZ 结构域相互作用抑制RISC 活性[10] 。马铃薯卷叶病毒属的P0 蛋白包含一个小F-box，通过F-box 与泛素降解途径与SCF 家族中的SKP1 相互作用而导致AGO1 的降解 [11-12] 。进一步的研究表明P0 与AGO1 的结合发生在AGO1 与siRNA 组装成RISC 复合体之前[3] 。

2GW 模型——新的抑制寄主RNA 沉默方式

尽管最近几年人们对基因沉默抑制因子在基因和物理机制鉴定方面的研究已经很深，但是我们对许多抑制因子功能方面的分子机制仍然不甚了解。Azevedo 等[2] 的报道填补了这一空缺。他们发现萝卜皱病毒(TCV) 的P38 外壳蛋白，作为一个众多周知的抑制因子通过一种新的机制抑制RNA 沉默。拟南芥编码多个DCL，已鉴定了其中的4个DCL 功能，不同的DCL 具有不同的功能。其中DCL4 和DCL2 具有协同抗病毒的作用，DCL4 是主要的识别和作用成分，其作用产生21 nt 的病毒siRNA，当DCL4 功能减弱或受阻后，则由DCL2 补偿发生作用，并产生22 nt 的病毒siRNA。已有遗传证据表明P38 能抑制DCL4 的功能[13] ，但Azevedo 等人发现缺失P38 的TCV 能成功地侵染dcl2-dcl4 双重突变而不是dcl4 单一突变，这表明P38 也可以抑制由DCL2 诱导的抗病毒沉默。P38 与AGO 的相互作用影响了DCL 的表达， DCL2 产生的22 nt 大小的viRNAs 可以优先和AGO1 结合， Azevedo 等[2] 猜测P38 能抑制AGO1 的功能。结果他们的猜测通过在侵染植物中和AGO1 共免疫沉淀所证实。更重要的是，他们发现P38 的N 端和C 端包含两个GW，而GW 是一个AGO 结合区域，能被一些细胞内蛋白所利用。GW 的N 端是保守的，存在于几乎所有的香石竹斑驳病毒属成员的P38 蛋白中，而其C 端只存在于TCV 的P38 蛋白。P38 在N 端和C 端的其中的一端或者两端发生点突变，由GW 变成GA，这个点突变就会使P38 失去结合AGO1 的活性，同时也失去了在烟草叶子瞬时表达中抑制基因沉默的能力，这表明了GW 在P38 具有的功能中起着重要作用。如果使P38 有两个GW->GA 点突变，携带这个突变体的TCV(TCVGA2) 不能侵染野生型植株，但是能侵染ago1 突变植株。这些结果说明了P38 的GW 重复不仅在调节与AGO1 相互作用方面也在依赖于AGO1 的RNA 沉默过程中起着重要作用。

细胞中的miRNA 平衡对AGO1 功能的抑制作用也有着重要作用。比如，在TCV 侵染的植物中，依赖于P38 抑制基因沉默的方式降低了以DCL1 为目标的miR162 的水平。因此，在TCV 侵染的植物中DCL1 蛋白含量急剧增加，DCL3 和DCL4 水平下降，这可能是DCLs 和DCL1 两者对抗的结果。

包含GW 模型的P38 和AGO1 的结合模拟了一些细胞内蛋白质结合AGOs，是RISC的组成部分。这些细胞内蛋白质已经确定来自酵母、植物和动物，并含有2~40个GW/WG 重复单元。GW/WG 重复单元作为AGO 钩，与AGO 相互结合，对转录中基因沉默(TGS) 和转录后基因沉默(PTGS) 有重要的作用。如酵母的Tas3蛋白包含2个GW/WG 重复，Tas3与AGO1 结合，并与组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase) Clr4 共同形成转录沉默复合体(transcriptional silencing complex，RITS) [14-18] 。在后生动物中广泛存在的GW182蛋白家族序列中包含多个GW/WG 重复，GW182 与AGO 蛋白结合并存在于mRNA 代谢体(Processing body，P-body或称为GW－body) 中，参与miRNA 介导的基因沉默[2,19] 。拟南芥中依赖于DNA 的RNA 聚合酶V(PolV) 大亚基NRPE1 序列中的C 端含有21个GW/WG 重复，通过该重复与AGO4 相互作用并引起RNA 介导的DNA 甲基化，从而产生转录基因沉默[20] 。PolV 的转录产物为不含有“帽子”和PolyA “尾巴”结构的RNA，这种RNA 作为分子伴侣(scaffold molecules) 协助siRNA 的AGO4 作用于与之配对的DNA 同源区，并通过DNA 甲基化转移酶DRM2 产生新的DNA 甲基化，导致转录水平的基因沉默[21] 。另一个包含GW/WG 的蛋白KTF1 与转录延伸因子SPT5 同源，在植物RdDM 途径的不同步骤中，作为受体蛋白与AGO4 结合并发挥作用[22] 。

3GW 是调节RNA 沉默的活性的通用工具

细胞内包含GW/WG 重复单元的蛋白都在TGS 或PTGS 有积极的作用。GW/WG 重复单元与AGOs 相互作用，促进了RISC的形成。病毒P38蛋白是基因沉默抑制因子，那么由GW 调节的P38 和AGO1 结合后又是怎样抑制基因沉默的？因为P38 似乎没有影响AGO1 蛋白的稳定性，所以P38 和AGO1 结合干扰了viRNAs 、siRNAs 与 AGO1 的结合，并进一步可能阻止AGO1 与具有功能的RISC 结合[2]（图1 [23]）。

因为细胞内包含GW/WG 的蛋白质包含RNA识别因子(如GW182) 或新的RNA结合序列(如KTF1) ，所以细胞内包含GW/WG 的蛋白质似乎与RNA 结合活性息息相关[22] 。RNA 结合活性很可能帮助AGO 结合siRNAs 以更有效的寻找和发现用于基因沉默的RNA。作为外壳蛋白，P38 也有RNA 结合活性，P38 可能与目标RNAs 相互作用并协助产生RISC，因此与细胞内GW/WG 蛋白结合RNA 存在竞争。尽管对于多细胞动物GW182 的同源蛋白在植物中没有报道，但是在植物中AGO1 可能需要和包含GW/WG 的蛋白相结合以形成具有功能的RISC。病毒P38 和细胞内包含GW/WG 的蛋白与AGO1 存在竞争性结合，并决定了以RNA 基因沉默为基础的寄主防御和病毒反防御之间的竞争。

GW/WG 蛋白能和AGOs 结合，它所调节的抑制基因沉默的方式可能被病原体和寄生虫用于对抗寄主RNAi 防御。事实上，另一个含GW 模型的病毒基因沉默抑制因子，甘薯斑点病毒(SPMMV， Potyviridae) 的P1 蛋白能与AGO1 相互作用，并抑制siRNA编码的RISC (Josef Burgyan， pers. Comm)。在Azevedo 等[2] 的研究中讨论了一些细菌性病原体单细胞[24] 的毒性因子包含GW 重复单元，其GW重复单元有可能与AGOs 相互作用并干涉哺乳动物的RNA 沉默。与此同时，传染性的阮病毒蛋白包含5个GW/WG 重复单元。阮病毒蛋白能结合RNAs[25]，其转化需要RNAs 的刺激[26]。因此，阮病毒的GW/WG 与AGOs 有间接相互作用，并且阮病毒蛋白与RNAs 可以结合，它们两者都有可能在阮病毒的转化和发病机理中起重要作用。Azevedo 等[2] 的研究说明了一个包含GW 重复单元的蛋白在寄主中抑制基因沉默的模型。其中最吸引人的推论是：细胞内一些包含GW 重复单元做为AGO 钩的蛋白可能还没有进化到成为RISC的一部分，但是它可以直接或间接调节RNA 沉默路径的活性。

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收稿日期：2011-09-22;修订日期：2011-12-23

基金项目：国家自然科学基金（30870109）

作者简介：申永梅(1987-)，女，山东菏泽人，在读研究生，主要从事植物病毒分子方面研究。

通讯作者简介：曹雪松(1962-)，男，安徽六安人，教授，主要从事植物病毒分子方面研究。