抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

王永 兰青阔 赵新 朱珠 程奕

摘要：以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象，利用环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65 ℃保温30 min，通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示，该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因，其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性，结果可靠，非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。

关键词：抗虫转Bt基因水稻；环介导等温扩增技术；检测

中图分类号：S511文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.01.002

Development and Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Transgenic Insect-resistant Rice with Bt Gene

WANG Yong，LAN Qing-kuo，ZHAO Xin，ZHU Zhu，CHENG Yi

（Central Lab of Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300381，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: To develop a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of transgenic insect-resistant rice with Bt（Bacillus thuringiensis）gene. The detection assay is based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction. The cry1Ac gene was amplified by a set of four specially primers that recognize six distinct sequences of the target. The amplification can be obtained in 30 min by incubating all of the reagents in a single tube with Bst DNA polymerase at 65 °C. Results showed that sensitivity of the LAMP assay were 10 times higher on the detection limit for cry1Ac gene than conventional PCR assay. Our results clearly demonstrated that the LAMP-based assay was a sensitive and reliable means for the detection of transgenic insect-resistant rice with Bt gene.

Key words: transgenic insect-resistant rice with Bt gene; loop-mediated isothermal amplification（LAMP）; detection

自1996年转基因作物开始大规模商业化种植以来，生物技术育种产业发展迅速，始终保持强劲的发展势头，转基因作物1996年种植面积190万hm2，2010年达到1.48亿hm2，市场产值从最初1995年的0.75亿美元增加到2010年的112亿美元，15年间增加近150倍[1]。然而转基因作物在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因生物的食用安全性及对环境的生态安全性方面。我国高度重视农业转基因生物安全管理，自2001年以来相继出台了一系列转基因生物安全条例和配套管理办法，特别是在2006年通过了《中华人民共和国农产品质量安全法》，明确规定在中国境内销售列入标识的转基因生物及其产品，必须进行是否含有转基因成分的标识。随着转基因食品的大量涌入市场，建立快速有效的转基因检测方法，为进一步完善我国农业转基因生物安全管理和转基因食品标识管理制度，保护消费者知情权方面提供重要技术保障。

目前，针对转基因水稻外源基因片段的检测方法常见的有PCR、实时荧光定量PCR法、色谱法、毛细管凝胶电泳法和多重PCR 等[2-3]。由于上述方法存在操作步骤繁琐，检测时间较长；对检验人员的知识、操作水平和仪器水平要求过高；难于实现现场实时检测和跟踪检测；检测成本过高等不足之处，方法较难普及。环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年Notomi开发的一种新的等温扩增方法。LAMP法原理是利用DNA双链在65 ℃左右处于一种动态解链平衡的状态之下，在链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）作用下，扩增出大量的DNA片段，几十分钟可达l09～l010个拷贝[4]。LAMP法广泛应用于包括病毒[5-7]、细菌[8-10]和寄生虫等传染性疾病的定性和定量检测，但用于转基因水稻检测还没有报到。在本研究中，将LAMP方法用于检测抗虫转Bt基因水稻的外源cry1Ac基因，以建立转基因水稻的基因特异性LAMP快速检测方法。

1材料和方法

1.1材 料

抗虫转Bt基因水稻科丰6号和非转基因水稻由天津市农业科学院中心实验室保存。

1.2仪器和试剂

ABI 2720基因扩增仪，梅特勒十万分之一分析天平，Neslab水浴锅，Beckman高速冷冻离心机，Nanodrop ND1000蛋白核酸测定仪， Bio-rad电泳仪，SYNGENE G-BOX凝胶成像分析仪等；所用试剂除特殊说明外，其它均购自BBI公司。

1.3样品DNA提取

参照农业部953号公告－6－2007[11]。

1.4引物设计及合成

根据LAMP引物设计原则，将GeneBank 公布的cry1Ac基因序列（accession number BD276264.1）[12]分成6个区段（F3/F3c区、F2/ F2c区、F1/ F1c区、B1/ B1c区、B2/ B2c区、B3/B3c区）（图1），其中LAMP扩增区域位于cry1Ac基因序列的23～243 bp之间，引物序列见表1。

引物由宝生物公司合成，纯度为HPLC级别。引物用灭菌去离子水溶解，配制成100 μmol·L-1母液，取FIP和BIP母液各8 μL，取F3和B3母液各1 μL，用灭菌去离子水补足20 μL，为引物混合溶液。

1.5LAMP扩增

LAMP反应在25 μL体系中进行，包括10×ThermoPol Reaction buffer（New England Biolabs）2.5 μL，0.2 mol·L-1 MgSO4 0.25 μL, 10 mmol·L-1 dNTP（Promega）1 μL，4 mol·L-1 Betaine（Sigma）6.25 μL，引物混合液1 μL，8 000 U·mL-1 Bst DNA聚合酶大片段（New England Biolabs）1 μL，DNA模板2 μL，灭菌去离子水补足25 μL。

反应体系在59~69 ℃下恒温扩增60 min，之后在80 ℃保温2 min灭活DNA聚合酶。扩增结束后取扩增产物10 μL，与溴酚兰混合，经2%琼脂糖凝胶电泳，100 V电压下40 min，在凝胶成像分析仪中观察结果。

1.6 PCR扩增

PCR 反应引物由上海生工参照文献[12]合成。PCR反应为25 μL体系，10×PCR buffer（Promega）2.5 μL，10 mmol·L-1 dNTPs（Promega）0.5 μL，上游和下游引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL，Taq酶（5 U·μL-1，Promega）0.5 μL，DNA模板1 μL，灭菌去离子水19.5 μL。反应程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，72 ℃延伸7 min。PCR产物取10 μL于2%琼脂糖凝胶电泳，100 V电压下40 min，通过凝胶成像分析仪观察结果。

2结果与分析

2.1LAMP反应条件优化

以含10 %转基因水稻DNA为模板，体系分别在59，61，63，65，67 ℃下温育60 min，取扩增产物4 μL，经2%琼脂糖凝胶电泳分析结果，结果显示体系在65 ℃下有扩增产物，且在65 ℃下条带较明亮清晰（图2）。以65℃为反应温度，对最少反应时间进行了研究，结果显示反应在60 min和75 min均出现扩增产物，并且结果一致（图2）。故本研究选择65 ℃为反应的最优扩增温度，60 min为最佳反应时间。

2.2LAMP灵敏度分析

取抗虫水稻品种科丰6号和非转基因水稻，液氮研磨呈细粉，干燥至恒质量。用十万分之一分析天平称取转基因水稻和非转基因水稻，按比例混合，使转基因水稻占总重的10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%、0 %，充分混匀，提取DNA。以上述DNA为模板分别进行LAMP扩增和PCR扩增，电泳结果见图3和图4。由图3可见，泳道1～7中均出现典型的LAMP的梯状带型，最低检测限度可以达到0.01％；由图4可见，泳道1～5 PCR都扩增出301 bp大小的特异性条带，且亮度逐渐降低，传统PCR扩增的最低检出限为0.5％，但亮度很弱。

3讨论与结论

目前在转基因生物产品成分检测中，定性PCR方法应用最为广泛。PCR法检测依赖PCR仪进行核酸体外扩增，其PCR扩增产物需要凝胶电泳分析才能完成，从扩增到出结果需要3 h左右，而且在操作过程中容易产生气溶胶污染，检测结果容易出现假阳性和假阴性。同PCR技术相比，LAMP技术在检测领域具有较大优势：（1）操作简便，反应不需要复杂的仪器，只需一个维持恒定温度的金属加热块或者水浴锅就能反应，产物分析可以用肉眼直接观察反应管内的混浊情况就可以判断扩增与否；（2）快速高效，检测灵敏度高，整个扩增1 h即可完成，产量可达到109~1010个拷贝，如果在反应中加入环状引物还可以促进扩增，减少反应时间；（3）特异性高，该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，具有高度特异性，不易出现假阳性结果，而且在环状引物上可以加上荧光探针，更进一步提高反应的特异性；（4）反应整个过程可以闭管操作，可以从源头上控制气溶胶污染。因此，本研究建立的转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性，结果可靠，非常适合转基因作物的快速检测，有较好的应用价值。

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收稿日期：2011-11-01；修订日期：2012-01-29

基金项目：国际合作项目（2006DFA32380）；天津市应用基础及前沿技术研究（08JCYBJC03700）

作者简介：王永（1977-），男，天津人，副研究员，硕士，主要从事农产品安全质量分子检测技术研究。

通讯作者简介：程奕（1963-），女，安徽歙县人，研究员，硕士，主要从事农产品质量检测研究。