猪场蚊子中乙型脑炎病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测

魏燕鸣

摘要：收集湖北省与安徽省部分猪场的蚊子样本，用ＲＴ－ＰＣＲ检测蚊子样本是否携带有乙型脑炎病毒，并对猪群乙型脑炎病毒抗体进行了检测。结果表明，５３份蚊子样品中乙型脑炎病毒阳性样品为４４份，表明这些猪场的蚊子广泛携带有乙型脑炎病毒。从阳性ＰＣＲ产物中随机选出８个，并将其克隆到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体中，得到５个阳性重组质粒，进行序列测定和进化树分析，结果表明阳性蚊子样本携带的都是基因Ⅲ型乙型脑炎病毒。猪场的1 401份血清样品的乙型脑炎病毒抗体阳性率为57.7%，说明这些猪场猪群的乙型脑炎病毒感染率较高。

关键词：猪场；蚊子；乙型脑炎病毒；ＲＴ－ＰＣＲ

中图分类号：Ｓ８５２．６５＋９．６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3104-03

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｉｇ Ｆａｒｍｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ

ＷＥＩ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ ａｎｄ Ａｎｈｕｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＪＥＶ） ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４４ ｏｕｔ ｏｆ ５３ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ， ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＪＥＶ ｗａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ． ８ ｏｆ ｔｈｅ ４４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ⅲ ＪＥＶ． The positive rate of JEV in 1 401 serum samples in the pig farms was 57.7%， indicating a high infection rate of JEV in these farms.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｇ ｆａｒｍｓ； ｍｏｓｑｕｉｔｏ； Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ； ＲＴ－ＰＣＲ

乙型脑炎病毒（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＥＶ）属于黄病毒科黄病毒属，是一种危害严重的人兽共患虫媒性传染病病原。该病毒具有很强的神经毒力，感染人后可以引起乙型脑炎。据估计，乙型脑炎全球每年平均发病５万例，死亡１．５万人，５７％～６８％的治愈者留有神经学后遗症［１］，其中严重者占１８％，约５０％病人有记忆缺损，３／４病人有运动失调和智力机能受损［２，３］。近年来，随着人类活动及全球气候的变化，乙型脑炎的流行在世界范围内呈上升趋势。同时，乙型脑炎也是危害中国养猪业的重大疫病之一。

猪是乙型脑炎病毒的重要储存宿主和扩增宿主，也是乙型脑炎的主要传染源［４］。一般情况下乙型脑炎病毒的感染呈猪—蚊—人链状［５］。因此，通过监测湖北省与安徽省部分猪场蚊子中乙型脑炎病毒的流行与分布情况，为猪场乙型脑炎临床防控提供参考。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１蚊子样品蚊子样品于２００９年６月至８月采自湖北省和安徽省部分猪场。

１．１．２菌种与试剂菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α、ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体购自北京全式金生物技术有限公司、所用限制性内切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、相应的缓冲液、ＤＮＡ分子质量标准ＤＬ ５ ０００购自宝生物工程（大连）有限公司；ＤＮＡ纯化回收试剂盒Ｃｙｃｌｅ－Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ、质粒小提试剂盒Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ ＫｉｔⅠ购自美国Ｏｍｅｇａ生物技术公司，反转录试剂盒ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ α ＴＭ购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，乙型脑炎乳胶凝集抗体检测试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。

１．１．３引物根据乙型脑炎病毒Ｅ蛋白基因序列设计并合成ＲＴ－ＰＣＲ所用的引物：Ｐ１：５′－ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＣＣ－３′；Ｐ２；５′－ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＣＡ ＣＣＡ ＡＡＣ－３′。扩增的靶序列为４６７ ｂｐ。

１．２方法

１．２．１样品总ＲＮＡ的提取将采集的猪场蚊虫样本用匀浆器研磨，制成悬液，反复冻融３次，以

３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取２００ μＬ上清匀浆液，加入８００ μＬ的Ｔｒｉｚｏｌ细胞裂解液，振摇混匀，于室温放置１０ ｍｉｎ；加入２００ μＬ氯仿，混合均匀，于室温放置１０ ｍｉｎ后，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ；将上层溶液转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，于室温放置１０ ｍｉｎ，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ；弃去上清液，加入１ ｍＬ体积分数为７５％的乙醇，洗涤沉淀，以８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ；弃去上清，于室温干燥５～１０ ｍｉｎ；加入２０～３０ μＬ ＤＥＰＣ水，溶解ＲＮＡ，直接用于反转录或保存于－８０ ℃冰箱备用。

１．２．２Ｅ蛋白基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增２０.0 μＬ的反转录反应体系如下：总ＲＮＡ模板１０.0 μＬ，５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４.0 μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２.0 μＬ，Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ０．５μＬ，ＡＣＥ－α ０．５ μＬ，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５ μＬ，灭菌水２．５ μＬ。反应条件：３０ ℃反应１０ ｍｉｎ，４２ ℃反应３０ ｍｉｎ，９９ ℃反应５ ｍｉｎ。所得的ｃＤＮＡ保存于－８０ ℃冰箱备用。

２５.0 μＬ的ＰＣＲ扩增体系如下：ｃＤＮＡ ３.0 μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，上游引物０．５ μＬ，下游引物０．５ μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ０．５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １７．５ μＬ。将上述反应体系混匀后进行ＰＣＲ扩增，反应条件：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９５ ℃变性４５ ｓ，５５ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。反应结束后，取３～５ μＬ ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

１．２．３重组质粒的构建ＰＣＲ产物经０．８％琼脂糖凝胶电泳分离后，用ＤＮＡ片段胶回收试剂盒回收。回收的ＰＣＲ产物连接到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体中，转化，然后筛选阳性克隆，提取重组质粒进行双酶切鉴定。

１．２．４重组质粒插入片段的序列分析将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）有限公司测序，测序结果用ＤＮＡＳｔａｒ软件分析，并与ＧｅｎＢａｎｋ中登录的其他乙型脑炎病毒的Ｅ蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较和分析。

１．２．５猪群乙型脑炎病毒抗体的检测从采集上述蚊子样品的猪场中随机采集猪血清１ ４０１份，然后利用乙型脑炎乳胶凝集抗体检测试剂盒对被检血清进行乙型脑炎病毒抗体的检测。

２结果与分析

２．１蚊子样品的RT-ＰＣＲ检测结果

提取样品的总ＲＮＡ后进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，检测结果如图１。结果表明，从样品中扩增出了与预期片段大小相符的特异性片段，长度为４６７ ｂｐ。５３份样品中阳性样品有４４份，阳性率达８３％，表明猪场蚊子携带乙型脑炎病毒的比例很高，猪感染乙型脑炎病毒的风险也很高。

２．２重组质粒的双酶切鉴定

纯化回收随机选取的８个阳性样本的ＰＣＲ产物，连接到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体上，转化后筛选获得阳性重组质粒，用Ｈｉｎ ｄＩＩＩ和Ｅｃｏ ＲⅤ双酶切鉴定，分别得到了与预期目标大小相符的２个片段，结果表明，目的片段连接、转化正确。其中２个阳性样本的双酶切结果见图２。

２．３Ｅ蛋白基因片段的序列分析

将上述８个阳性重组质粒测序后，利用ＤＮＡｓｔａｒ软件对序列进行分析。结果表明，从命名为ＨＢ３Ｃ、ＨＢ２２Ｂ、ＨＢ３３Ａ、ＨＢ４１Ｂ、ＨＢ４８Ｂ的阳性重组质粒扩增得到的５个插入序列的大小均为４６７ ｂｐ。同时，从网上下载了１1株乙型脑炎病毒的Ｅ蛋白基因序列。用ＤＮＡｓｔａｒ生物学分析软件对这１6个乙型脑炎病毒Ｅ蛋白基因序列进行同源性比较，绘制遗传进化树（图３）。结果表明，１6个乙型脑炎病毒Ｅ蛋白基因序列分别存在于两个分支上，其中ＨＢ２２Ｂ与ＨＢ４８Ｂ的来源一致，与ＡＹ３７６４６１的遗传距离较近。而样本ＨＢ３Ｃ与ＨＢ３３Ａ的来源一致，ＨＢ４１Ｂ与网上选取的１1株乙型脑炎病毒的遗传距离较近。进一步分析发现，５个阳性蚊子样本携带的均为基因Ⅲ型乙型脑炎病毒。

２．４乙型脑炎病毒抗体检测结果

乳胶凝集试验检测结果显示，在１ ４０１份临床血清样品中，乙型脑炎抗体阳性样品为８０８份，阳性率为５７．７％。

３小结与讨论

通过ＲＴ－ＰＣＲ检测方法检测了２００９年在湖北省与安徽省两省部分猪场采集的蚊虫样本中的乙型脑炎病毒Ｅ蛋白基因片段，阳性检出率达到了８３％。结果显示，所选猪场蚊子普遍携带乙型脑炎病毒，鉴于蚊子在乙型脑炎病毒传播中的中间宿主作用，所选猪场的猪群感染乙型脑炎病毒的风险较大。同时，为了进一步查明这些猪场猪群的乙型脑炎病毒血清流行病学情况，还利用乳胶凝集试验对这些猪场的１ ４０１份血清样品进行了检测，结果表明乙型脑炎病毒抗体阳性率为５７．７％，说明这些猪场猪群的乙型脑炎病毒感染率较高。

有资料报道，乙型脑炎病毒分为４型，来自于泰国北部及柬埔寨地区的毒株属于基因Ⅰ型；来自于泰国南部、马来西亚、印度尼西亚的毒株属于基因Ⅱ型；来自于日本、中国等地区的毒株属于基因Ⅲ型；部分来自印度尼西亚的ＪＫＴ６４６８毒株独自形成了基因Ⅳ型［６］。但是近十多年来，乙型脑炎病毒基因型的地域有了新的变化。如韩国和日本已经报道发现基因Ⅰ型乙型脑炎病毒［７］。研究在进行乙型脑炎病毒检测的同时，随机选取了８个阳性样本，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出了乙型脑炎病毒Ｅ蛋白基因片段，并将Ｅ蛋白基因片段连接到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体上，对得到的阳性重组质粒进行测序，最后得到５个正确质粒。用生物学分析软件ＤＮＡｓｔａｒ对从ＧｅｎＢａｎｋ上下载的１1株其他乙型脑炎病毒的Ｅ蛋白基因序列以及５个正确的阳性重组质粒测序结果进行了同源性比较和分析，并绘制了遗传进化树。结果表明，检测的蚊子携带的乙型脑炎病毒均属于基因Ⅲ型，说明在中国湖北、安徽两省的基因Ⅲ型乙型脑炎病毒可能属于主要基因型。

综上所述，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法对湖北、安徽两省部分猪场蚊子携带乙型脑炎病毒的情况进行了检测，并利用乳胶凝集试验对这些地区猪群乙型脑炎病毒抗体进行了评价，初步证实了湖北、安徽两省猪场蚊子乙型脑炎病毒的携带率较高，猪群乙型脑炎病毒感染率也较高，从而为更深入阐明华中地区猪群乙型脑炎病毒的分子流行学与血清流行学规律打下了基础。

参考文献：

［１］ ＫＡＵＲ Ｒ，ＲＡＵＴＨＡＮ Ｍ，ＶＲＡＴＩ Ｓ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｏｆ ａ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ａｄｓｏｒｂｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４， ２２（２１－２２）：２７７６－２７８２．

［２］ 俞永新．地区性国际乙型脑炎控制策略会议简介［Ｊ］． 中国生物制品学杂志，１９９６，９（１）：４６－４８．

［３］ 马士恒，陈宇萍，王占国． 乙型脑炎研究进展［Ｊ］． 中国人兽共患病杂志，２００１，１７（１）：９５－９７．

［４］ 殷震，刘景华． 动物病毒学［Ｍ］． 第二版．北京：科学出版社，１９９７． ６３１－６４０．

［５］ 张中，杨厚安，段小卫，等． 流行性乙型脑炎的防控［Ｊ］． 畜牧与饲料科学，２０１０，３１（１１－１２）：１５１－１５２．

［６］ ＳＯＬＯＭＯＮ Ｔ，ＮＩ Ｈ，ＢＥＡＳＬＥＹ Ｄ Ｗ，ｅｔ ａｌ． Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａ［Ｊ］． Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３，７７（５）：３０９１－３０９８．

［７］ ＮＧＡ Ｐ Ｔ，ＰＡＲＱＵＥＴ Ｍ Ｄ，ＣＵＯＮＧ Ｖ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｓｈｉｆｔ ｉｎ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＪＥＶ） ｇｅｎｏｔｙｐｅ circｕｌａｔｉｎｇ ｉｎ Nｏｒｔｈｅｒｎ Ｖｉｅｔｎａｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎs ｆｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＪＥＶ ｆｒｏｍ Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ａｓｉａ ｔｏ Ｅａｓｔ Ａｓｉａ［Ｊ］． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，２００４，８５（６）：１６２５－１６３１．