提取板栗ＤＮＡ的ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法的比较

王少斌 程水源 王燕 许锋 姜德志 陈慧娟 李琳玲 程华

摘要：分别采用十六烷基三乙基溴化铵（ＣＴＡＢ）法和十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）法提取板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．）基因组ＤＮＡ，取适量ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳，并利用紫外可见分光光度计测定所提取的ＤＮＡ在２６０和２８０ ｎｍ的吸光度及其比值，利用Ｅｃｏ ＲⅠ和ＭｓｅⅠ双酶切后进行随机扩增长度多态性（ＡＦＬＰ）分析。结果表明，两种方法均能从板栗中提取出一定质量的、比较完整的、纯度比较高的ＤＮＡ，ＳＤＳ法提取的板栗ＤＮＡ的纯度更高、质量更好。

关键词：板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．）；DNA提取；十六烷基三乙基溴化铵（ＣＴＡＢ）法；十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）法；随机扩增长度多态性（ＡＦＬＰ）

中图分类号：Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3101-03

Comparison of CTAB and SDS Methods for DNA Extracion of Chestnut

ＷＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ－ｙｕａｎ２，３，ＷＡＮＧ Ｙａｎ２，ＸＵ Ｆｅｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，２，ＣＨＥＮ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ１，

ＬＩ Ｌｉｎ-ｌｉｎｇ２，３，ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ２，３

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ of Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｃｈｅｓｔｎｕｔ（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．） ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＥｃｏＲⅠ ａｎｄ ＭｓｅⅠ ｆｏｒ ＡＦＬＰ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｂｏｔｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ ｗｈｉｌｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ with ｈｉｇｈｅｒ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｏｓｓｉｍａ ＢＬ．； DNA extraction； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ； ＡＦＬＰ

板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ ＢＬ．）是壳斗科栗属落叶乔木，是一种重要的园艺作物，其经济栽培价值高［1］。迄今为止，人们对板栗的研究很多，但多集中于板栗的种植、病虫害防治及板栗壳的利用等方面，而对板栗基因组ＤＮＡ的研究相对较少。基因组ＤＮＡ的提取及ＤＮＡ分子标记的应用是构建基因文库和遗传图库等分子生物学研究的基础［２－４］。由于板栗富含酚类、糖类、脂肪、色素以及单宁等次生代谢物，给获得板栗基因组ＤＮＡ带来了较大困难，提取高质量ＤＮＡ更加不易。此外，传统方法提取的ＤＮＡ得率低、纯度低，难以进行酶切及ＰＣＲ扩增，进而影响随机扩增长度多态性（ＡＦＬＰ）等技术在板栗上的应用。采用十六烷基三乙基溴化铵（ＣＴＡＢ）法和十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）法分离板栗基因组ＤＮＡ，通过比较这两种方法提取的ＤＮＡ的质量，以期优化板栗高质量ＤＮＡ模板提取的方法，旨在为板栗的分子水平研究打下基础。

１材料与方法

１．１材料

板栗果实取自于罗田县胜利镇板栗试验基地，品种为“罗田乌壳栗”。将果实用液氮速冻后放入

－８０ ℃低温冰箱里保存过夜，然后撕去外壳及内皮层以外部分，分离果肉，将其剪碎，加液氮研磨。

１．２方法

１．２．１ＤＮＡ的提取方法

１）ＣＴＡＢ法。参照Ｌｏｈ等［５］的方法并加以改良来提取板栗的基因组ＤＮＡ，具体步骤如下：①取５ ｇ新鲜的板栗果实于液氮中研磨至粉末，迅速转移到１０ ｍＬ离心管中；②加入４ ｍＬ于６５ ℃预热的ＣＴＡＢ提取液（２０ ｇ／Ｌ ＣＴＡＢ、ｐＨ ７．５的１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０的５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ），于６５ ℃水浴１ ｈ；③以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１２ ｍｉｎ后，取上清液加入等体积的体积比为24∶1的氯仿、异戊醇混合液，充分混匀，于冰上静置１０ ｍｉｎ；④以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１２ ｍｉｎ，取上清液，加入等体积的异丙醇于－２０ ℃沉淀２０ ｍｉｎ；⑤以１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取沉淀，用体积分数为７５％的乙醇清洗沉淀３次，每次３０ ｍｉｎ；⑥用适量的ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ，并加入５ μＬ ＲＮａｓｅＡ，于３７ ℃水浴３０ ｍｉｎ消化ＲＮＡ；⑦加入等体积的体积比为24∶1的氯仿、异戊醇混合液，抽提２次；⑧用２倍体积的体积分数为９５％的乙醇和１／１０体积的３ ｍｏｌ／Ｌ NaAc沉淀ＤＮＡ；⑨用体积分数为７５％的乙醇清洗ＤＮＡ ３次；自然干燥后，加１００ μＬ ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ。

２）ＳＤＳ法。步骤同上述ＣＴＡＢ法，仅将提取液改为ＳＤＳ提取缓冲液［ｐＨ ５．２的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ ｇ／Ｌ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ）、１４ ｇ／Ｌ ＳＤＳ、体积分数为０．５％的β－巯基乙醇］，提取时加入２／３体积的ｐＨ ４．８的２．５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ，冰浴３０ ｍｉｎ。

１．２．２ＤＮＡ质量的检测方法①取１０ μＬ ＤＮＡ溶液用ＴＥ缓冲液稀释至５００ μＬ，检测ＤＮＡ样品在２６０、２８０ ｎｍ的吸光度Ａ２６０ ｎｍ、Ａ２８０ ｎｍ。利用Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ评价ＤＮＡ样品的纯度。②取５ μＬ ＤＮＡ样品，加２ μＬ溴酚蓝上样缓冲液，于０．８％琼脂糖凝胶中电泳，用ＥＢ染色，拍照。用０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ的完整性以及是否降解。③取５００ ｎｇ ＳＤＳ法提取的总ＤＮＡ用Ｅｃｏ ＲⅠ和Ｍｓｅ Ⅰ进行双酶切，采用１２．５ μＬ反应体系：Ｅｃｏ ＲⅠ／ＭｓｅⅠ １．２５ Ｕ，５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ，５００ ｎｇ ＤＮＡ和ｄｄＨ２Ｏ。试验中做了不同的酶切处理：分别在精密恒温仪和ＰＣＲ仪上于３７ ℃酶切１、２、４、６ ｈ，然后于８０ ℃处理２０ ｍｉｎ。最后按照李勇慧等［６］的方法进行ＡＦＬＰ标记分析。

２结果与分析

２．１ＤＮＡ样品的质量分析结果

由表１和表２可知，采用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ的产率显著高于采用ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ的产率，通过ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ平均值为１．６７，说明采用ＣＴＡＢ法提取的板栗ＤＮＡ含有大量杂质，纯度较低。通过ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ平均值为１．８６，基本排除了酚类、多糖、蛋白质等次生物质的干扰，ＲＮＡ去除得干净，获得的ＤＮＡ溶液质量高。采用ＳＤＳ法提取的板栗ＤＮＡ的产率为采用ＣＴＡＢ法提取的１．３７倍，纯度也较高，获得的模板ＤＮＡ的质量和纯度完全能够满足ＰＣＲ扩增的要求。

２．２ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳分析结果

图１、图２分别是采用ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ在琼脂糖凝胶上的电泳图谱。由图１可知，各个样品均有一条单一信号强度的主带，主带清晰、完整性好、降解少，几乎没有弥散条带，样品孔不发亮。说明ＲＮＡ和蛋白质已去除干净，所得ＤＮＡ的质量较高。由图２可知，采用ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ降解较多、完整性差、条带均弥散，但仍能提取板栗果实的ＤＮＡ。

２．３双酶切和ＡＦＬＰ分析结果

以八月红板栗、羊毛栗、乌壳栗、中果早栗、六月苞板栗、玫瑰红板栗、中迟栗、油栗为试验材料，采用ＳＤＳ法提取ＤＮＡ，并将双酶切后的ＤＮＡ样品连接接头后进行ＰＣＲ扩增，然后取适量扩增产物在１．５％的琼脂糖凝胶中电泳，每个样品均呈现出弥散的带型，说明采用ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ能被Ｅｃｏ ＲⅠ和Ｍｓｅ Ⅰ两种限制性内切酶完全切割，并且ＡＦＬＰ分析的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱条带清晰、带数多。如图３所示，扩增条带信号强度一致性很好，条带分布均匀，能够得到稳定、清晰、分辨率较高的指纹条带，可进行板栗的遗传变异分析。

３讨论

１）在分子水平的研究中，保证ＤＮＡ的纯度很重要，也是最基本的，它直接关系到后续试验能否顺利进行。板栗果实研磨较难、耗时太长将影响ＤＮＡ的品质，在提取之前须先碎成小块再加液氮。板栗果实中的蛋白质、色素、蔗糖等成分含量较高，试验多次用氯仿提取能够有效除去样品中的蛋白质，加速有机相与液相的分离，去除板栗果实中的色素、蔗糖等。试验结果显示ＳＤＳ比ＣＴＡＢ法更有效。采用２０ ｇ／Ｌ ＳＤＳ和体积分数为２％的β－巯基乙醇提取后，再采用氯仿提取，所得ＤＮＡ样品的纯度高，所含蛋白质等小分子杂质少，符合随机扩增长度多态性（ＡＦＬＰ）分析的要求。沉淀时间和温度对ＤＮＡ的产量和纯度都有影响，试验在－２０ ℃沉淀２０ ｍｉｎ，既使ＤＮＡ充分沉淀又保证了纯度，由于ＤＮＡ是多聚阴阳离子的水溶性化合物，在沉淀时加入适量的ＮａＡｃ有助于ＤＮＡ析出并且不会变性［７］。

２）在提取过程中，需要尽量保证板栗ＤＮＡ的完整性，主要从几个方面防止板栗ＤＮＡ的降解：①板栗果实质地较为坚硬，研磨较难，加液氮研磨时要迅速，动作要轻柔、温和，尽可能将它研碎；②温育４０ ｍｉｎ时裂解还不够充分，ＤＮＡ得率较低，温育１ ｈ才看到ＤＮＡ絮状沉淀，因此，对板栗而言，在样品研得很细的前提下，至少需要１ ｈ才有足够的ＤＮＡ产生；③由于板栗含有大量的色素和酚类物质，提取的物质容易褐化，试验在缓冲液中加入体积分数为２％的β－巯基乙醇和２０ ｇ／Ｌ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ），提取的ＤＮＡ完全为白色絮状沉淀，没有出现褐化的迹象，提取物符合后续试验要求。而且试验还发现，最终将ＤＮＡ溶于ＴＥ缓冲液中比溶于去离子水中保存的时间更长，更不易降解。

参考文献：

［１］ 周连第，兰彦平，曹庆昌． 板栗基因组ＡＦＬＰ银染反应体系的建立［Ｊ］．果树学报，２００６，２３（１）：１７－２０．

［２］ 陈旭辉，高玉葆，朱敏杰． 小叶锦鸡儿基因组ＤＮＡ的提取及ＡＦＬＰ反应体系的建立［Ｊ］． 植物研究，２００９，２９（５）：５２９－５３３．

［３］ 黄绍辉，方炎明． 改进的ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法提取濒危植物连香树ＤＮＡ［Ｊ］． 武汉植物学研究，２００７，２５（１）：９８－１０１．

［４］ ＤＯＹＬＥ Ｊ Ｊ，ＤＯＹＬＥ Ｊ Ｌ． Ａ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｆ ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ Ｂｕｌｌ，１９８７， １９（１）：１１－１５．

［５］ ＬＯＨ Ｊ Ｐ，ＫＩＥＷ Ｒ，ＫＥＥ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＡＦＬＰ） ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｌａｄｉｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｂｏｔ，１９９９，８４（２）：１５５－１６１．

［６］ 李勇慧，李向明．用扩增片段的长度多态性分子标记探讨盾叶薯蓣的遗传多样性［Ｊ］． 植物生理与分子生物学学报，２００７，３３（４）：３４１－３４８．

［７］ 朱英，陶刚，刘作易． 普遍适用于农作物基因组ＤＮＡ的提取方法及提取值得注意的几个问题［Ｊ］． 贵州农业科学，２００５， ３３（５）：２０－２１．