SSR法鉴定水稻两系杂交种纯度的运用与探讨V.不同引物检测同一品种纯度的准确性V.不同引物检测同一品种纯度的准确性

赵虹 张宇飞 林梅 廖芳丽 熊先锋 涂书新 张凯

摘要：试验将同一样品用不同引物检测纯度，发现不同引物检出的纯度结果不同。用SSR法检出的纯度结果不同引物之间的误差随着样品田间纯度的增高而呈现出降低的趋势。当品种不同时，室内检测结果有可能高于或低于田间鉴定结果。因此难以找到普遍适用的室内与室外检测的系统误差校正方法。

关键词：两系杂交稻；同一样品；不同引物；SSR法；田间鉴定；纯度比较

中图分类号：S511；Q789文献标识码：A文章编号：0439-8114（2012）20-4458-02

利用SSR分子标记鉴定两系杂交稻种子纯度，具有快速、稳定、重复性好、多态性高的优点，是目前室内鉴定两系杂交稻种子纯度时应用最为广泛的分子标记方法。该方法一般是从大量的引物中筛选出多态性高、共显性强、双亲谱带清晰的一对引物，然后用这对引物来鉴定两系杂交稻种子的纯度[1-5]。在试验操作中筛选出的引物往往不止一种，这些引物对同一品种都具有多态性，且都符合引物筛选的标准。这就意味着多对引物都可用于一个品种的纯度鉴定，为筛选引物和鉴定品种提供了方便。就完全相同的一份样品而言，用不同引物鉴定是否都能得出相同的纯度结果，很少见诸报道[6-10]。此次研究的目的在于探讨同一样品用3～4对不同的引物检测纯度，并与田间鉴定结果比对，分析不同引物检测结果的差异，判断不同引物检测两系杂交稻种子纯度的准确性和可靠性。

1材料与方法

1.1材料

试验所用品种苯两优639、天两优616、两优17均为湖北省种子管理局提供，2010年已做过田间正季鉴定，分别代表全省当年种子纯度高、中、低3个类型的样本群体。

所用引物及试剂均由北京鼎国生物有限公司提供。

1.2引物选择和DNA模板制备

各品种所用的引物已由前面试验筛选出，其中两优17和天两优616选用4对引物，苯两优639选用3对引物（表1）。DNA模板的制备采用农业部推荐的简易法，其中，用于SSR引物筛选的DNA模板为田间10个标准单株的混合物，用于种子纯度鉴定的DNA模板为样品单株DNA提取物。

1.3PCR反应体系

PCR扩增反应总体积10 μL：10×buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL primer 0.2 μL+0.2 μL，2 U/μL Taq 酶0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；然后进行35个循环的扩增，循环参数为94 ℃、15 s，55 ℃、15 s，72 ℃、30 s；最后在72 ℃下延伸7 min。扩增产物在含EB的3%琼脂糖凝胶中进行电泳后，应用凝胶成像系统观察记录。

1.4田间纯度鉴定及单株定位方法

以上3个品种都进行了田间正季鉴定，于2011年4月15日播种，5月15日移栽。每品种田间种植1个小区，每小区500株，50行，每行10株，行距26.7 cm，株距16.7 cm。每个植株用4位数编号，前两位数代表所在的行数，后两位数表示所在行的位置，例如0508表示第五行的第八株，并设亲本对照。在抽穗前及齐穗后分两次按GB/T 3543.5—1995进行田间纯度鉴定，并观察比较各品种间的植物学形态特征和生物学特性。

1.5室内鉴定

在秧苗移栽20 d后，在田间按植株编号逐株剪取倒数第二叶，用于SSR法室内纯度检测，其中两优17有效鉴定株数495株，天两优616有效鉴定株数316株，苯两优639有效鉴定株数344株。

1.6室内及田间鉴定结果比对

将同一品种使用不同引物作出的室内鉴定结果与田间鉴定结果比较，并比较不同引物室内鉴定结果之间的差异，判断不同引物检测结果的准确性与一致性。

2结果与分析

2.1同一样品不同方法的鉴定结果比较

无论是田间方法还是室内方法鉴定，3个样品的纯度从低到高依次为两优17、天两优616、苯两优639（表2）。

室内鉴定结果与田间鉴定结果是不一致的。室内鉴定结果与田间鉴定结果比较，两优17的4对不同引物鉴定结果中，与田间鉴定结果差距最小的为RM212，比田间纯度低1.2个百分点，差距最大的为RM21，比田间纯度低5.2个百分点；苯两优639的3对不同引物鉴定结果中，与田间鉴定结果差距最小的为RM17和RM208，均比田间纯度高0.2个百分点，差距最大的为RM263，比田间纯度高0.8个百分点；天两优616的4对不同引物鉴定结果中，与田间鉴定结果差距最小的为RM243，比田间纯度高1.0个百分点，差距最大的为RM263，比田间纯度高3.2个百分点。就不同品种而言，有的室内纯度鉴定结果高于田间鉴定结果，有的室内纯度鉴定结果低于田间鉴定结果，其中，两优17的室内鉴定，所有引物鉴定结果纯度都比田间低，平均低2.6个百分点；天两优616的室内鉴定，所有引物鉴定结果纯度都比田间高，平均高1.8个百分点；苯两优639的室内鉴定，所有引物鉴定结果纯度都比田间高，平均高0.4个百分点。

2.2同一样品不同引物检测结果比较

同一样品不同引物检出纯度有差异。两优17引物间纯度最大相差4.0个百分点，达4.67%；与田间纯度比较最大相差5.2个百分点，达6.08%，这已经超出了误差允许范围。天两优616引物间纯度最大相差2.2个百分点，达2.30%；与田间纯度比较最大相差3.2个百分点，达3.35%。苯两优639各引物间纯度相近，与田间纯度鉴定结果也基本一致，可见室内SSR检出纯度是田间纯度的近似值。

3结论与讨论

试验中，纯度较高的种子样品室内多对引物的SSR法和田间鉴定的结果差异较小，否则差异较大。同时也存在下述问题，值得探讨。

3.1引物筛选时，应该关注引物对样品的针对性

两优17用引物RM21检出的纯度为85.5%，比目前公认的田间鉴定法低5.2个百分点，相对误差达6.08%，已超出了统计学可忽略的误差范围。而引物RM212检出的纯度为89.5%，比田间鉴定法低1.2个百分点，接近大田生产鉴定结果，说明引物对样品纯度的分子生物学鉴别能力不同。因此，当样品纯度较低时，筛选出的引物对样品是否有针对性显得尤为重要。

3.2室内鉴定与田间鉴定结果之间有差距，且差距变化的方向不确定

从试验中看出，受检品种用SSR法检测的纯度结果有的高于田间纯度鉴定结果，有的低于田间纯度鉴定结果，误差的变化方向摆动不定。例如两优17用多个引物检出的纯度均低于田间纯度，而天两优616均高于田间纯度。这说明室内与田间两种纯度检测方法所测出的结果之间具有复杂性，而寻求某种简便通用的误差校正方法存在较大的难度。

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