鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗研究报告(Ⅰ报)

罗玲 杨峻 邵华斌 王红琳 罗青平 温国元 张蓉蓉 艾地云 罗明杰

摘要：用鉴定筛选的大肠杆菌接种适宜培养基，将培养物经甲醛溶液灭活后，分别制备氢氧化铝胶灭活疫苗、油乳剂灭活疫苗，经检验合格，用于安全和效力试验，比较两种佐剂制备的灭活疫苗的免疫效力。结果表明，氢氧化铝胶作为佐剂制备区域优势血清型疫苗来预防本地的鸭大肠杆菌病效果更好。

关键词：鸭大肠杆菌病灭活疫苗；佐剂；免疫效果

中图分类号：Ｓ８５８．３２文献标识码：A文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０12）04-0013-0

禽大肠杆菌是一种潜在的人畜共患病病原［１］，鸭大肠杆菌病的发生日趋严重，给养鸭业造成了严重的经济损失。由于鸭大肠杆菌的耐药日趋严重，疫苗免疫成为预防该病的有效手段，但大肠杆菌病流行广泛，其血清型众多，不同地区差异较大，国内外还没有有效的疫苗来防治该病，所以用本地分离鉴定和筛选的病原菌株来制备多价灭活疫苗对预防该地的鸭大肠杆菌病效果更好。本研究选用从湖北省分离鉴定筛选的３株疫苗菌株制备氢氧化铝胶灭活疫苗，经安全性、免疫效力试验证明此疫苗效果较理想。

１材料与方法

１．１试验材料

１．１．１试验用菌种试验用菌种及效力检验用强毒均由本实验室鉴定、保存和提供。

１．１．２试验鸭为地方麻鸭，购买后饲养观察７ｄ无异常，即用于后续试验。

１．２试验用疫苗制备与检验

１．２．１制苗用菌液的制备用玻璃瓶或培养罐通气培养，按容积装入７０％培养基及花生油消沫剂。灭菌后按培养基量的２％～４％接种各菌株混合的二级种子液，各菌株种子混合比例为ＥＣ７８∶ＥＣ４５∶ＥＣ８为１∶１∶１。开始小量通气，逐渐增大气量，３６～３７℃培养１０～１４ｈ。菌液培养完成后取样作纯粹检验［２］（应达到纯粹标准）。同时活菌计数［２］，每毫升活菌应不低于１５亿个。按０．４％加入甲醛溶液，经３８℃灭活４８～７２ｈ，期间每隔４～６ｈ振摇一次，作灭活检验［２］。

１．２．２疫苗的制备

１．２．２．１氢氧化铝胶灭活疫苗的制备每５份菌液加１份氢氧化铝，同时按总量的０．００５％加硫柳汞，充分振荡，于２～８℃静置２～３ｄ，抽弃上清浓缩成全量的６０％，于２～８℃条件下保存备用。

１．２．２．２油乳剂灭活疫苗的制备

油相制备：注射用白油９４份、司本－８０ ６份、硬脂酸铝２份，配油相时，先取少量注射用白油与硬脂酸铝混合，加热溶化，再与全量司本－８０及注射用白油混合均匀，１１６℃灭菌３０ｍｉｎ，备用。

水相制备：吐温－８０ ４份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加入菌液９６份，充分振摇，使吐温－８０完全溶解为止。

乳化：取油相３份放于胶体磨内，慢速转动搅绊，同时缓慢加入水相１份，加完后再以１０ ０００ｒ／ｍｉｎ搅拌２～５ｍｉｎ，在终止前加入１％硫柳汞溶液使其最终浓度为０．００５％。乳化后，取３～５ｍＬ以３ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，若有分层现象，应重复搅拌１次。

１．２．３疫苗的检验对制备的疫苗进行无菌、安全性和效力检验。

１．２．３．１无菌试验按文献［２］介绍的方法进行无菌检验。

１．２．３．２疫苗的安全试验选取１周龄的健康易感鸭３０只，分３组，每组１０只。第１组采用制备的氢氧化铝胶疫苗颈部皮下或肌肉注射１ｍＬ／只；第２组采用油乳剂疫苗颈部皮下或肌肉注射１ｍＬ／只；第３组颈部皮下或肌肉注射灭菌生理盐水１ｍＬ／只。观察１４ｄ。

１．３两种佐剂疫苗免疫效果比较试验

选取２周龄健康易感鸭４０只，分４组，每组１０只。第１组每只颈部皮下接种氢氧化铝胶灭活疫苗０．５ｍＬ，第２组每只肌肉注射氢氧化铝胶灭活疫苗０．５ｍＬ，第３组每只颈部皮下接种油乳剂灭活疫苗０．５ｍＬ，第４组为对照组，不接种任何疫苗。免疫后２１ｄ，各组肌肉注射强毒株混合液０．５ｍＬ／只（含活菌２亿～５亿个），观察１４ｄ，记录每组健活数和死亡数，计算每种疫苗免疫攻毒保护率。

２结果与分析

２．１疫苗的无菌试验结果

试验结果表明，两种佐剂制备的疫苗均无菌生长。

２．２疫苗的安全性试验结果

由表１可见，两种佐剂制备的疫苗免疫的７日龄雏鸭均健活，精神、食欲正常，迫杀剖检无任何肉眼可见病变。

２．３两种佐剂疫苗免疫效果试验结果

由表２可见，氢氧化铝胶疫苗和油乳剂灭活疫苗免疫１４日龄的雏鸭，免疫保护率均不低于８０％，达到疫苗规定的要求。

３小结与讨论

本试验用从湖北地区筛选的菌株制备氢氧化铝胶灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗，并进行了安全性和免疫效果的比较试验。安全性试验结果表明，用两种佐剂制备的疫苗免疫鸭，试验鸭均健活。免疫效果试验结果油乳剂灭活疫苗和氢氧化铝胶灭活疫苗可以达到同等的免疫保护率（不小于８０％），但是在用油乳剂灭活疫苗进行免疫时部分雏鸭产生了一定的应激反应，氢氧化铝胶灭活疫苗进行免疫时雏鸭没有应激反应。试验结果表明，选用氢氧化铝胶作为佐剂制备区域优势血清型疫苗来预防本地的鸭大肠杆菌病效果更好。

参考文献：

［１］卡尔尼克Ｂ Ｗ． 禽病学［Ｍ］．高福，刘文军，主译．第九版．北京农业大学出版社，１９９１．４２７－４４４．

［２］中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典（２００５年版）［Ｍ］． 中国农业出版社，２００５．