传染性法氏囊病病毒PY05株的分离鉴定

卢佳 张宇耕 崔保安 李新生 刘媛媛 陈礼鹏 岳旭龙 王俊亚

摘要：为了分离到鸡传染性法氏囊病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）病毒，从河南省濮阳地区某疑似感染鸡法氏囊病病毒的鸡场采集病料，用ＳＰＦ鸡胚对病毒进行分离培养，通过琼脂扩散试验和ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＶＰ４片段对其进行鉴定。结果显示该毒株能引起鸡胚规律性死亡，且出现ＣＡＭ增厚、鸡胚出血等明显病变；待检抗原、标准阳性血清之间出现阳性沉淀线；琼脂电泳得到大小约为１ ２００ｂｐ片段，与预期结果相符。结果证明该分离株为ＩＢＤＶ地方株，并命名为ＰＹ０５株。

关键词：鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）；分离；鉴定

中图分类号：Ｓ８５８．３１文献标识码：A文章编号：１００７－２７３Ｘ（２０12）04-0009-02

鸡传染性法氏囊病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ）引起的鸡的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性传染病［１］。该病主要侵害３～１２周龄幼鸡，以损伤鸡的法氏囊为主要特征，使鸡群产生严重、长期的免疫抑制，从而对其他细菌及病毒性疾病继发感染的敏感性增加［２］。给养殖业带来严重的经济损失。本试验从河南省濮阳地区某鸡场疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集病料进行分离，通过血清学等方法对该毒株进行了鉴定。现将鉴定过程报告如下。

１材料与方法

１．１材料

病料采自河南省濮阳地区某小型养鸡场的疑似传染性法氏囊病病鸡的法氏囊、脾脏组织；ＳＰＦ鸡胚及ＳＰＦ鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；ＩＢＤＶ阳性血清购自中国兽医药品监察所；ＲＮＡ提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

１．２方法

１．２．１病料的处理将采集的病料剪碎、充分研磨后按１∶３的比例加入灭菌的ＰＢＳ液，制成匀浆后反复冻融３次，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，将处理后的悬液用无菌ＥＰ管分装，于－８０℃保存备用。

１．２．２病毒的分离与传代将１．２．１处理的原始病料悬液滴鼻、点眼接种５只４周龄ＳＰＦ鸡，扑杀在接种后３～４ ｄ出现临床症状的病鸡，采集法氏囊混合，按１．２．１的方法处理制成悬液。悬液按１∶１０４倍稀释，０．２ｍＬ／胚接种１０日龄ＳＰＦ鸡胚绒毛尿囊膜，３７℃孵育，弃去２４ｈ内死亡鸡胚，其余２４ｈ后死亡的鸡胚无菌收取尿囊膜、尿囊液，混合，研磨后８ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，连续５次传代。

１．２．３琼脂扩散试验 按常规方法测定发病鸡只中的ＩＢＤＶ抗原，梅花形孔中央加入ＩＢＤＶ标准阳性血清，外周孔加入已处理过的法氏囊组织，另外加入ＩＢＤＶ标准抗原做对照。

１．２．４病毒ＲＮＡ的提取处理过的病料使用Ｔｒｉｚｏｌ离心柱型高纯总ＲＮＡ快速提取试剂盒按其产品说明的方法提取。

１．２．５引物的设计与合成参照ＧｅｎＢａｎｋ有关ＩＢＤＶ病毒ＶＰ４片段序列及Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计一对引物Ｐ１和Ｐ２，进行ＲＴ－ＰＣＲ反应［３］。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：Ｐ１：５′－ＧＣＡＴＡＣＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧＧＧ－３′；Ｐ２：５′－ＣＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＡＴＧＧ－３′。

２结果与分析

２．１病毒的分离与传代

接种的鸡胚于４８～９６ｈ内死亡，收集的鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液研磨处理后在鸡胚上连续５次传代。该病毒在鸡胚上死亡时间稳定在６０ｈ左右，且鸡胚绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）明显增厚，胚体出血（图１，图２）。

２．２琼脂扩散试验

待检抗原、标准抗原与阳性血清之间出现的沉淀线完全融合，显示为阳性（图３）。

２．３ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果

ＰＣＲ产物通过１％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统显示，片段大小为１ ２００ｂｐ左右，与预期相符合（图４）。

３小结与讨论

从河南省濮阳地区某疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集病料，通过琼脂扩散试验、分子生物学试验等检测方法，证实分离的病毒为鸡传染性法氏囊病病毒，将其命名为ＰＹ０５株。该病毒在鸡胚传代过程中，可引起鸡胚规律性的死亡，产生明显的病变。通过琼脂扩散试验，显示为阳性，出现明显的沉淀线。ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果显示，得到与预期相符合的１ ２００ｂｐ左右的片断［4］。

ＩＢＤＶ主要侵害鸡的中枢免疫器官—法氏囊，能引起鸡的免疫抑制，从而对其他细菌性及病毒性疾病的易感性增强，给养鸡业带来严重的经济损失［５］。目前鸡传染性法氏囊病仍是养禽业防制的主要对象，对于该病的预防，传统的预防措施主要是使用弱毒疫苗和灭活疫苗来控制疾病的感染［6］，尽管源于经典毒株的各种法氏囊病疫苗在防制传染性法氏囊病的过程中起到重要的作用，但由于变异毒株和超强毒株的出现，现有的疫苗不能提供有效保护，常导致免疫失败和带来经济损失［7］。因此，寻找合适的方法研制新型疫苗，也成为兽医工作者面临的重要课题。另外，养鸡户在对鸡群进行ＩＢＤ免疫同时，应加强饲养管理、保持环境卫生、减少其他疾病的发生和影响，这样才能更好更有效的预防ＩＢＤ的发生［8］。

参考文献：

［１］殷震，刘景华，动物病毒学［Ｍ］．第二版．北京：科学出版社，１９９７．５８２－５８５．

［２］ＫＩＢＥＮＧＥ Ｆ Ｓ，ＤＨＩＬＬＯＮ Ａ Ｓ，ＲＵＳＳＥＬＬ Ｒ Ｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｕｓ，1９９８，６９（Ｐｔ８）１７５７－１７７５．

［３］荣俊，刘晓娜，程太平，等． 传染性法氏囊病 ＲＴ－ＰＣＲ诊断方法研究［Ｊ］．中国预防兽医学报，２０００，２２（Ｓ１）：１８－２１．

［4］ＷＥＩ Ｙ Ｗ，ＬＩ Ｊ Ｒ，ＺＨＥＮＧ Ｊ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｎａｔｕｒｅ［Ｊ］． ＢＢＡ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｉ，２００６，３５０（２）：２７７－２８７．

［５］ＹＥＨＵＤＡ Ｈ，ＰＩＴＣＯＶＳＫＩ Ｊ，ＭＩＣＨＡＥＬ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ：ａ ｖｅｒｙ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｖｉｒｕｓ，ｉｔｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｆｏｒｍ， ａｎｄ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］． Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ，１９９９，４３（１）：５５－６４．

［7］ＰＹＴＣＯＶＳＫ Ｉ Ｊ，ＧＵＴＴＥＲ Ｂ，ＧＡＬＬＩＬＩ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｕｓｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＶＰ２ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅ－ｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］． Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３， ２１： ４７３６－４７４３．

［6］ＭＡＲＡＶＥＲ Ａ，ＣＬＥＭＥＮＴＥ Ｒ，ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ Ｊ Ｆ，ｅｔ ａl． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ-ｂｉｎｄｉｎｇｍｏｔｉｆ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｎｅｒ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ３［Ｊ］． Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００３，７７（４）：２４５９-２４６８．

［8］王永强．鸡传染性法氏囊病病毒ＶＰ３及 ３＇ＵＴＲ对病毒复制的影响［Ｄ］． 北京：中国农业科学院，２００９．