阻断Notch信号抑制角质形成细胞的分泌功能的研究

李冰,刁建升,楚菲菲,王大雷,郭树忠,夏炜

[摘要]目的：探讨Notch信号对角质形成细胞分泌功能的影响及意义。方法：采用角质形成细胞的血清刺激模型研究Notch信号对其分泌功能的影响。结果：血清刺激可以明显促进Notch受体，配体及下游基因的表达，其中Notch1，Jagged1的表达明显上升并具有时间依赖性，其下游蛋白P21表达升高，并在血清刺激后6h达到高峰，P63表达下降，并在血清刺激后6h，下降幅度最大。此外给予血清刺激后，纤维化相关因子（包括TGF-β1，TGF-β2，IGF-1，CTGF，VEGF及EGF）的表达明显升高，并在12h达到高峰。给予DAPT（N-[N-(3,5-Difluorophenancetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester，γ分泌酶抑制剂)进行Notch信号阻断后，明显抑制其下游蛋白P21的表达，提高的P63的表达水平，同时抑制了纤维化相关因子的表达。结论：阻断Notch信号能够明显抑制角质形成细胞分泌纤维化相关因子。

[关键词]瘢痕；Notch信号；角质形成细胞；血清刺激模型；纤维化相关因子

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）04-0576-04

Blocking Notch signal pathway suppress profibrotic growth factor production in keratinocyte

LI Bing,DIAO Jian-sheng,CHU Fei-fei,WANG Da-lei, GUO Shu-zhong, XIA Wei

(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impact of Notch signaling on the profibrotic growth factor production in keratinocyte.MethodsTo mimic the components of the acute wound microenvironment, we used serum stimulation model in vitro.Results We found that expression of Notch1 and Jagged-1 in keratinocytes was significantly higher after serum stimulation, and shown time independent. After keratinocytes serum stimulation, the expression of P21 was significantly up-regulated and had a peak at 6h, while the expression of P63 was down-regulated with the biggest fall at 6h. Besides, the result of real time PCR suggested that nearly all the detected profibrotic growth factors had a peak at 12h after serum stimulation, in absence of DAPT. DAPT decreased the expression of profibrotic growth factor production at all the indicated time, and had the most potent effect at 12h. But in presence and absence DAPT, the variation tendency of TGF-β1 expression was nearly the same, so was VEGF. Maybe this is related to the low dose of DAPT(10μM).ConclusionBlocking Notch signaling pathway can suppress probrotic growth factor production in keratinocyte.

Key words:cicatrix; Notch signal pathway; keratinocyte; serum stimulation model; profibrotic growth factor

皮肤创伤后过度愈合常常导致瘢痕增生，尤其是大面积烧伤后常形成增生性瘢痕，不仅影响外表，而且常会给患者带来功能障碍，影响患者身心健康。但其发病机制目前尚未明确阐明。表皮异常的旁分泌功能在瘢痕增生中发挥着重要作用[1-3]。在本课题组前期的研究中发现，在增生性瘢痕的表皮增厚，但其基底细胞减少，上层细胞增多，即表现为增殖减低，过度分化状态，同时发现Notch信号相关分子在增生性瘢痕表皮过量表达及活化[4]。此外，本课题组前期利用DAPT局部注射能够明显抑制兔耳瘢痕增生[5]，同时增生性瘢痕表皮的过度分化状态也得到了逆转。Notch信号是调节表皮增殖分化的重要信号途径，因此我们推测，创伤后，可能由于Notch信号相关分子的大量表达及过度活化导致表皮的增殖分化异常[6-7]，进而产生大量的纤维化相关因子，导致瘢痕增生。本研究即通过血清刺激模型，体外模拟体内急性创伤，来研究Notch信号对角质形成细胞分泌功能的影响，为Notch信号在瘢痕增生中促进作用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂及材料：角质形成细胞购买于美国ATCC公司，无血清KGM（Serum free basal keratinocyte growth medium，无血清角质形成细胞基础培养基）及添加剂购买与美国ATCC公司；胰酶及EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetie Acid，乙二胺四乙酸）产于英国Sigma公司，购买于西安沃尔森生物技术公司；DAPT（N-[N-(3,5-Difluo rophenancetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester，γ分泌酶抑制剂)产于美国ALEXIS公司，购买于西安沃尔森生物技术公司；FCS（（fetal calf serum，胎牛血清）产于美国Hyclone公司，购买于西安沃尔森生物技术公司；TriPure分离试剂产于德国Roche公司，购买于西安沃尔森生物技术公司；反转录试剂盒及SYBR GreenⅠ实时荧光定量试剂盒产于并购买于大连宝生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 角质形成细胞培养： 冻存的角质形成细胞以1000～5000细胞/cm2密度复苏后培养于无血清的KGM完全培养基中, 当细胞达到70%～80%融合，利用0.02%胰酶和0.05%EDTA进行消化传代，直到第四代细胞用于血清刺激模型建立。

1.2.2 血清刺激模型建立及DAPT处理： 将角质形成细胞在KGM成基础培养基中静置17h，加入或不加10μM DAPT，孵育2h后，加入10%FCS，于血清刺激后0h、1h、6h、12h及24h收集细胞及培养上清。

1.2.3 Real-time PCR检测：采用TriPure试剂按说明书进行RNA提取。DNase I 37℃，10～3Omin，以去除基因组DNA污染。RNA沉淀，重悬后进行定量。利用反转录试剂盒按照说明书对RNA进行反转录。采用SYBR Green I染料在MJ Research 0ption 2荧光定量PCR仪上检测目的基因的表达。PCR反应体系20μl。PCR反应条件：激活95℃，10 min；40个循环，变性95℃，15 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s；分别在78℃、80℃、82℃和85℃时检测荧光。扩增完毕后，进行熔解曲线分析，95℃，1 min，65℃，l min，以0.10℃/s的速度升温到95℃，连续监测荧光。扩增结束后分析熔解曲线，在熔解曲线上以具有单峰判断PCR扩增的单一性。同时设无模板对照，每份标本行3次Rea1-time PCR检测，取平均值。对cDNA模板进行倍比稀释，以1.0×、0.5×、0.25×、0.125×四个浓度梯度的cDNA模板进行Rea1-time PCR扩增。将不同浓度模板的对数和相应到达阈值的循环数(ct值)作图，做标准曲线。基因mRNA表达采用直线相关回归分析，管家基因GAPDH的表达量作为内参照，分析目的基因的相对表达量。

1.2.4统计学处理：应用STAT4．0软件进行统计分析，用方差分析处理数据。

2结果

2.1 血清可以明显刺激角质形成细胞Notch信号相关分子的表达与活化。血清刺激后，Notch1及Jagged1表达明显上升，并呈现时间依赖性。此外，Notch下游分子，P21表达明显升高，并在血清刺激后6h达到高峰（P=0.0004）；P63表达下降，并在血清刺激后6h下降幅度最大（P<0.0001）。

2.2 血清明显刺激纤维化相关因子的表达。由于给予细胞的是单次血清刺激，所以我们只能短时间观察纤维化相关因子表达变化。其中TGF-β2、IGF-1、CTGF及EGF于血清刺激后12hmRNA表达高峰，到24h表达开始下降；而TGF-β1表达缓慢升高，直到血清刺激24h尚未出现明显表达高峰；VEGF于血清刺激后1h即出现了明显的高表达。

2.3 阻断Notch信号抑制了纤维化相关因子的表达。由于我们在给予血清刺激前2h及对细胞进行了DAPT处理，因此血清刺激0h，Notch信号下游分子及纤维化相关因子表达即出现不同的表达差异。DAPT明显抑制了P21表达，1h即达到了最大的抑制作用（P<0.0001）；DAPT处理后，P63表达明显升高，12h升高作用达到最大（P<0.0001）。TGF-β2（P=0.0147）、IGF-1（P<0.0001）、CTGF（P<0.0001）及EGF（P=0.0004）于血清刺激12h，DAPT的抑制作用达到最大；TGF-β1（P=0.0003）及VEGF（P=0.0033）于血清刺激1h，DAPT即有明显抑制作用。

3 讨论

Notch信号通路是人体重要信号通路之一，其信号分子在机体内的各个器官中均有表达，调节细胞周期、细胞增殖及凋亡。皮肤作为人体重要的器官，Notch及其配体在表皮细胞的多种细胞均有大量表达，且特异性的Notch信号活化在维持皮肤细胞自身更新及分化过程中起到重要意义。

人类细胞的Notch存在五种配体：Delta like1，Delta like3，Delta like 4，Jagged1及Jagged2；及四种受体：即Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。在人表皮中，各层表皮细胞均有Notch1分子表达，但Notch2只表达在基底细胞表面，而且Notch配体（例如：Jagged和Delta-like家族）与Notch受体作用是交叉的[8-9]。尽管Notch配体和受体的表达模式有差异，但通过对人类和小鼠的角质形成细胞研究结果表明，任何配体激活的Notch信号都具有诱导分化的能力[10-11]。Notch在表皮的研究中，主要集中的Notch信号对表皮增殖及分化的调节作用的研究。在表皮，Notch信号活化后，直接诱导其下游分子P21表达，抑制P63表达，进而诱导表皮分化，抑制表皮增殖。P21具有调节细胞周期的功能，也被称为Waf-1和Cip-1[10]。P21的表达增多会导致正在增殖的角质形成细胞出现细胞周期停滞，进而促进细胞向终末期细胞分化；而P63在维持表皮的增殖能力中起着重要作用。在Notch信号对病理性瘢痕的作用研究中发现，增生性瘢痕组织中出现角质形成细胞的过渡分化，其原因可能与Notch1和Jagged1在角质形成细胞过表达引起P21表达上调P63表达下调有关[11]。

表皮的分泌功能在皮肤的病理生理过程中都起到了重要作用。大量的研究表明，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的表皮常常会大量的分泌纤维化生长因子（包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF、PDGF、bFGF 等），这些生长因子透过基底膜到达真皮，进而促进真皮成纤维细胞的增殖及胶原合成，导致瘢痕增生[12-14]。但是关于Notch信号对表皮分泌功能的影响目前尚未见报道。而我们利用血清刺激模型进行的体外研究发现，阻断Notch信号后，不仅抑制了血清刺激的表皮的增殖能力下降及过度分化状态，也抑制表皮细胞分泌纤维化相关因子（包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF）。

Notch信号是生物进化中存在的非常保守的信号途径之一。其活化后影响很多下游基因的转录，目前在表皮研究的Notch作用比较确定直接的下游分子即包括P21和P63，此外还有Wnt信号，AP-1等[5]。但是关于Notch对纤维化相关因子的转录调节，目前相关研究还很少，而且多是集中在Notch信号于VEGF的相互作用在血管再生方面的研究[15]。关于Notch信号于TGF-β相互作用的研究多集中在内脏器官的纤维化方面[16-17]，即TGF-β促进了内脏器官内皮细胞向间质细胞转换，阻断Notch信号后，可以明显抑制TGF-β的作用，但并未指出二者是上下游的调节关系。而我们的研究提示Notch信号参与表皮分泌纤维化相关因子的调节，阻断Notch信号可以抑制表皮的分泌功能，进而抑制瘢痕形成，为瘢痕形成提供了新的机制，为瘢痕防止提供新的治疗思路。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-16

编辑/张惠娟