赤水河下游水产品中辛基酚和壬基酚的测定

高智席1,吴艳红,黎司,胡明华,牟青松,曾启华

摘要：建立了固相萃取－反相高效液相色谱法测定水产品中辛基酚和壬基酚残留量的检测方法。样品经三氯乙酸溶液提取，阴离子交换固相萃取柱净化。色谱柱为Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ ２５０ ｍｍ × ４．６ ｍｍ，检测波长为２２５ ｎｍ，流动相为甲醇－水（体积比为７５∶２５），流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，进样量为２０ μＬ。辛基酚和壬基酚分别在０．１３～９７．９２ μｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９６ １）、０．０２～５０．００ μｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９９ ４）浓度范围内与峰面积成良好线性关系，辛基酚和壬基酚的回收率为８７．４％～９３．７％，相对标准偏差为１．３％～３．９％。该方法准确、快速、灵敏度高，适用于水产品中辛基酚和壬基酚的检测。

关键词：辛基酚；壬基酚；水产品；反相高效液相色谱法

中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－0999-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ Ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ ｉｎ Ａｑｕａｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｃｈｉｓｈｕｉｈｅ Ｒｉｖｅｒ

ＧＡＯ Ｚｈｉ－ｘｉ１，ＷＵ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＬＩ Ｓｉ２，ＨＵ Ｍｉｎｇ－ｈｕａ１，ＭＵ Ｑｉｎｇ－ｓｏｎｇ１，ＺＥＮＧ Ｑｉ－ｈｕａ１

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００３０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｇｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ（RP-HPLC） ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ established ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ， ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ MAX－ＳＰＥ． Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ ｃｏｌｕｍｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ＣＨ３ＯＨ ａｎｄ Ｈ２Ｏ（７５∶２５，Ｖ／Ｖ）． Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ， ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｔ ２２５ ｎｍ， and the injection volume was 20 μL． Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．１３～９７．９２ μｇ／ｍＬ（Ｒ２＝０．９９６ １）、０．０２～５０．００ μｇ／ｍL（Ｒ２＝０．９９９ ４） ｆｏｒ ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ８７．４％ to ９３．７％ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ １．３％ to ３．９％． Ｆｉｎａｌｌｙ， Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｃｃｕｒａｔｅ， ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ， ａｎｄ ａｄａｐｔｓ ｔｏ ｔｈｅ detection ｏｆ ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ ｉｎ ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ； ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ； ａｑｕａｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ； ＲＰ－ＨＰＬＣ

辛基酚（Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ，ＯＰ）和壬基酚（Ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ，ＮＰ）是世界野生动物基金会列出的６７种环境激素中的２种［１］，广泛用于合成非离子表面活性剂和抗氧化剂，这类物质主要在污水处理过程中以生物降解产物的形式进入环境。众多体内外的生物研究表明，辛基酚和壬基酚作为内分泌干扰物质会在生物体内积累，并通过食物链进入人体，对人体癌细胞生长及生殖能力均会产生严重影响，具有雌激素效应和慢性毒效应［２］，因而已被欧盟列为优先危害物质。其对人类健康和生态环境的危害，已引起世界各国的普遍关注。

目前，关于辛基酚和壬基酚的分析方法主要有高效液相色谱法［３，４］、超临界流体色谱法［５］、胶束电动色谱法［６］、毛细管电泳法［７］、酶联免疫法［８］、气相色谱－质谱法［９－１１］和液相色谱－串联质谱法［１２］等，涉及的主要为生物、环境、食品、玩具和纸张等样品。这些研究均表明辛基酚和壬基酚广泛地存在于各种环境基质中，对人类赖以生存的食品存在着潜在的威胁。相对于环境样品，水产品的高脂肪、高蛋白的特点和烷基酚的脂溶性特点决定了其样品前处理的复杂性。目前还未见辛基酚和壬基酚在水产品中的污染状况和分析方法的相关报道。

本研究采用固相萃取－反相高效液相色谱－二极管阵列检测技术建立了水产品中的辛基酚和壬基酚的分析方法，并且对赤水河下游水产品进行了分析，取得了满意的结果。

１材料与方法

１．１仪器及试剂

ＬＣ－２０ＡＴ高效液相色谱仪（日本岛津公司），配备ＳＰＤＭ－２０Ａ检测器、ＳＩＬ－２０Ａ自动进样器、ＣＢＭ－２０Ａ系统控制器；氮吹仪（天津奥特赛斯）；电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；离心机（上海手术器械厂）；固相萃取仪（美国ＳＵＰＬＣＯ）；微孔过滤装置（北京莱伯泰科仪器有限公司）；ＳＹ３２００超声波清洗器（上海声源超声波仪器设备有限公司）；ＤＨＧ－９０７０Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（宁波江南仪器厂）。

壬基酚（纯度９９％，美国Ｃｈｅｍ Ｓｅｒｖｉｃｅ公司）；辛基酚（纯度９９％，美国Ｓｉｇｍａ公司）；甲醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；氨水（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；混合型阴离子交换固相萃取柱（艾捷尔，６０ ｍｇ，３ ｍＬ）；１％三氯乙酸溶液；２％乙酸铅溶液；二次蒸馏水。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ滤膜过滤。

１．２标准溶液的配制

分别称取１５．０ ｍｇ ＮＰ和ＯＰ标准品， 用甲醇溶解并定容至２５ ｍＬ棕色容量瓶中于４ ℃下保存。使用前用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。

１．３样品的前处理

１．３．１提取称取试样１０．００ ｇ于１００ ｍＬ 聚四氟乙烯离心管中，准确加入４８ ｍＬ １％三氯乙酸溶液和２ ｍＬ ２％乙酸铅溶液，高速均质器以１１ ０００ ｒ／ｍｉｎ 均质３０ ｓ，摇床上振荡３０ ｍｉｎ，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ［１３］。

１．３．２净化依次用３ ｍＬ 甲醇、３ ｍＬ 水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，准确吸取１０ ｍＬ 上清液过柱，控制过柱速度在１ ｍＬ／ｍｉｎ 以内，再用３ ｍＬ 水、３ ｍＬ 甲醇洗涤混合型阴离子交换固相萃取柱，抽至近干后，用３ ｍＬ ５％氨化甲醇溶液洗脱。收集洗脱液于１０ ｍＬ 离心管中，５０ ℃下氮吹至干。准确吸取１ ｍＬ ２０％甲醇溶液溶解残渣，混匀，０．４５ μｍ 滤膜过滤待测［１３］。

１．４色谱条件

色谱柱：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ）；流动相：甲醇－水（体积比７５∶２５）；流速：０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：３５ ℃；进样量：２０ μＬ；ＯＰ和ＮＰ的检测波长均为２２５ ｎｍ。

２结果与分析

２．１ＳＰＥ柱的选择

混合型阴离子交换固相萃取柱是以阴离子交换及反相吸附混合机理、以水可浸润型聚合物为基质的ＳＰＥ小柱。提供双重保留模式，即离子交换与疏水保留。本试验采用混合型阴离子交换固相萃取柱，既可除去样品中的干扰物质，又可有效提取样品中的目标物［１３］。

２．２检测条件的优化

２．２．１波长的选择利用二极管阵列检测器扫描可得到最大吸光波长都出现在２２５ ｎｍ处。水产品中各杂质在该波长时对ＯＰ和ＮＰ的测定无影响， 且色谱峰型对称。因此，选择２２５ ｎｍ作为本方法的最适检测波长。

２．２．２流动相的选择分别对甲醇－水、乙腈－水、甲醇－氨水、甲醇－磷酸二氢钾溶液、乙腈－离子对溶液、乙腈－磷酸缓冲溶液、甲醇－冰乙酸和四氢呋喃－水等流动相系统进行了考察。再比较不同配比的甲醇－水体系，发现甲醇－水体积比为７５∶２５时，柱效最高，保留时间适宜。

２．２．３流速的选择在波长、流动相等测量条件一定的情况下，分别设置流速为０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９和１．０ ｍＬ／ｍｉｎ进行检测，发现０．８ ｍＬ／ｍｉｎ时峰形好、出峰时间适宜，故选择流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ。

２．３线性方程和检出限

分别配制一系列的标准工作溶液，在选定的色谱条件下进行测定，计算出ＯＰ和ＮＰ的线性方程和相关系数。ＯＰ和ＮＰ分别在０．１３～９７．９２ μｇ／ｍＬ、０．０２～５０．００ μｇ／ｍL范围内与峰面积有良好的相关性，回归方程为ｙ＝５ ０１０．８００ｘ－５１．１７１、ｙ＝５ １３９．０００ｘ－８４．１９９，相关系数分别为０．９９６ １和０．９９９ ４，能够满足定量分析的需要。以信噪比为３计算检出限，水产品中ＮＰ和ＯＰ的检出限均为０．４ μｇ／ｋｇ。ＯＰ和ＮＰ标准品色谱图见图１。

２．４方法的回收率和精密度

采用经测定不含有ＮＰ和ＯＰ的水产品空白样品，分别进行添加回收率和精密度试验，样品中添加不同浓度的标准溶液，按本方法进行试验（水产品回收ＮＰ和ＯＰ色谱图见图２）。在低、中、高的３个添加水平范围内的平均回收率（每个添加浓度平行测定６次），草鱼样品回收率为８８．７％～９３．７％，相对标准偏差为１．３％～３．７％；对虾样品的回收率为８７．４％～９１．３％，相对标准偏差为２．３％～３．６％；螃蟹样品的回收率为８８．９％～９３．７％，相对标准偏差为２．２％～３．９％。回收率和精密度结果见表１。

３结论

本试验建立了固相萃取－反相高效液相色谱法测定水产品中辛基酚和壬基酚残留的分析方法。研究结果表明，该方法检出限低、重现性好、精密度高，并且操作简便、快速，是一种有效监测水产品中辛基酚和壬基酚含量的方法。

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