生物酶法提取沙棘果渣总黄酮工艺的优化

2012-04-29徐升运,赵文娟,陈卫锋,任平,秦涛

湖北农业科学 2012年5期

徐升运,赵文娟,陈卫锋,任平,秦涛

摘要：用生物酶法提取沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）果渣中的总黄酮，通过单因素试验和正交试验优化提取工艺。结果表明，酶解体系各因素对总黄酮提取率影响的大小顺序为酶用量、酶解温度、酶解时间、ｐＨ，最佳提取条件为生物酶用量占沙棘果渣质量的４％、ｐＨ５、酶解温度６０ ℃、酶解时间１２０ｍｉｎ，料水质量比１∶３０，此条件下总黄酮提取率可达到０．７９６％。与有机溶剂回流法和超声波法相比，生物酶法所得沙棘果渣的总黄酮提取率分别提高了５１．９１％和４８．５１％。

关键词：生物酶法；沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）果渣；总黄酮；提取工艺

中图分类号：Ｒ２８４．２；Ｓ７９３．６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－0983-03

ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＢｉｏ－ｅｎｚｙｍｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＴｏｔａｌＦｌａｖｏｎｅｓＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＭａｒｃｏｆＳｅａＢｕｃｋｔｈｏｒｎ

ＸＵＳｈｅｎｇ－ｙｕｎ１，ＺＨＡＯＷｅｎ－ｊｕａｎ１，ＣＨＥＮＷｅｉ－ｆｅｎｇ２，ＲＥＮＰｉｎｇ１，ＱＩＮＴａｏ２

（１．ＥｎｚｙｍｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳｈａａｎｘｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｎ７１０６００，Ｃｈｉｎａ；

２．ＳｈａａｎｘｉＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｅｎｔｅｒｏｆＥｎｚｙｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｎ７１０６００，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅｍｅｔｈｏｄｗａｓａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｍａｒｃｏｆｓｅａｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）；ａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉon ｃｒａｆｔｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉon ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｅｎｚｙｍｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｅｎｚｙｍｅｄｏｓｅ，４％ｏｆｔｈｅｍａｓｓｏｆ marc of ｓｅａｂｕｃｋｔｈｏｒｎ；ｐＨ，５； Tｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，６０ ℃； Tｉｍｅ，１２０ｍｉｎ； Mａｓｓｒａｔｉｏｏｆｍａｔｅｒｉａｌｔｏｗａｔｅｒ，１∶３０．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓｗａｓｕｐｔｏ０．７９６％．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｅａｔｒｅｆｌｕｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｕｌｔｒａ－ｓｏｎｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ５１．９１％ａｎｄ４８．５１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｉｏ－ｅｎｚｙｍｅｍｅｔｈｏｄ；ｍａｒｃｏｆ sｅａｂｕｃｋｔｈｏｒｎ（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ）；ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｅｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

沙棘（ＨｉｐｐｏｐｈａｅｒｈａｍｎｏｉｄｅｓＬ．）又名醋柳，是胡颓子科沙棘属的多年生灌木，是极为珍贵的药食两用植物，其果实、枝杆、叶中含有多种生物活性物质和营养成分［１］。沙棘总黄酮是研究最多的沙棘活性成分之一，具有抗心肌缺血、降血脂、抗肿瘤，调节免疫系统等药理作用［２－４］。经过大量人工种植与对野生沙棘资源的合理保护与开发，中国已成为沙棘种植第一大国，沙棘资源的开发与利用为中国“三北”贫困地区农民增收脱贫发挥了巨大作用。目前我国中西部沙棘加工企业主要是用带短枝沙棘果实榨汁和取油，榨汁后产生的大量果渣常被丢弃，仅有少部分被用作廉价的饲料。而有研究表明，沙棘总黄酮在其果渣中的含量还相当高［５］，有的甚至高于其在果汁与油中的含量［６］。因此，研究沙棘果渣总黄酮的提取对延伸沙棘加工产业链，提升沙棘开发利用的经济价值具有积极意义。

已有的报道主要探讨了有机溶剂结合超声、微波、热加工等物理方法提取沙棘果渣中总黄酮的方法［５－８］，而生物酶法可利用酶的专一性高效降解并充分释放出原料中的总黄酮，可以提高提取率、减少有机溶剂用量、简化提取流程。本研究主要应用单因素试验和正交试验优化生物酶提取沙棘果渣中总黄酮的方法，并与化学提取法相比较，以期得到更优的提取工艺和品质更高的沙棘黄酮产品，为沙棘高端医药产品的生产提供原料，为沙棘资源的开发与利用提供理论依据。

１材料与方法

１．１材料与仪器

沙棘果渣，于２００９年８月取自吴起县某野生沙棘加工企业，主要含果皮、果渣和沙棘短枝，６０ ℃干燥制粉，过１００目筛备用。

试剂：复合酶（由纤维素酶与果胶酶组成，使用最佳ｐＨ为４．０～６．０）；芦丁（Ｂ．Ｒ），聚酰胺粉（粒度为２００～３００目，柱层析用），乙醇、甲醇、氢氧化钠均为分析纯。仪器：贝克曼Ｄ６４０紫外分光光度仪；ＳＫ２５０超声发生器；电子天平（精度０．１ｍｇ，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

１．２方法

１．２．１沙棘总黄酮含量的测定［９］分别吸取浓度为50 μｇ／ｍＬ的芦丁标准溶液０、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍＬ于１０ｍＬ比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，测定３６０ｎｍ处吸光度，以芦丁浓度为横坐标，Ａ３６０ｎｍ为纵坐标绘制标准曲线，得芦丁浓度Ｃ（μｇ／ｍＬ）对吸光度Ｙ（Ａ３６０ｎｍ）的回归方程Ｙ＝０．０２５５Ｃ－０．００４４，Ｒ２＝０．９９９４。

１．２．２沙棘果渣总黄酮提取工艺流程①生物酶法。沙棘果渣→烘干→粉碎→生物酶酶解→醇溶液浸提→取上清液→浓缩→黄酮粗品→分析。②超声波法［４］。沙棘果渣→加入溶剂（乙酸乙酯、乙醇等）→超声波提取→过滤→浓缩→蒸干溶剂→黄酮粗品→分析。③有机溶剂回流法［４］。沙棘果渣→加入溶剂（石油醚、乙醇等）→热回流提取→过滤→浓缩→蒸干溶剂→黄酮粗品→分析。

１．２．３单因素试验分别考察酶解体系生物酶用量、ｐＨ、酶解温度、酶解时间、料水质量比对沙棘果渣总黄酮提取率的影响。①生物酶用量。在料水质量比１∶４０，酶解温度５０ ℃，ｐＨ５．０，酶解时间６０ｍｉｎ，生物酶用量分别占沙棘果渣质量的１％、２％、３％、４％、５％和６％的条件下提取总黄酮，考察生物酶用量对总黄酮提取率的影响。②ｐＨ。在生物酶用量占沙棘果渣质量的４％，酶解温度５０ ℃，料水质量比１∶４０，酶解时间６０ｍｉｎ，ｐＨ分别为３、４、５、６、７的条件下提取总黄酮，考察ｐＨ对总黄酮提取率的影响。③酶解温度。在料水质量比１∶４０，生物酶用量占沙棘果渣质量的４％，ｐＨ为５．０，反应时间６０ｍｉｎ，酶解温度分别为３０、４０、５０、６０、７０ ℃的条件下提取总黄酮，考察酶解温度对总黄酮提取率的影响；④酶解时间。在料水质量比１∶４０，生物酶用量占沙棘果渣质量的４％，ｐＨ５．０，酶解温度５０ ℃，酶解时间分别为３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０ｍｉｎ的条件下提取总黄酮，考察酶解时间对总黄酮提取率的影响。⑤料水质量比。在生物酶用量占沙棘果渣质量的４％、ｐＨ５．０、酶解温度５０ ℃、酶解时间１２０ｍｉｎ，酶解体系中料水质量比分别为１∶１０、１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０、１∶６０的条件下提取总黄酮，考察料水质量比对总黄酮提取率的影响。测定所得提取液的Ａ３６０ｎｍ，计算其中总黄酮的浓度和质量，总黄酮提取率＝提取所得总黄酮的质量／沙棘果渣质量×１００％。

１．２．４正交试验设计在单因素试验的基础上，设计Ｌ９（３４）正交试验，优化提取工艺，因素和水平见表１。

２结果与讨论

２．１生物酶用量对沙棘果渣总黄酮提取率的影响

随着反应体系中酶用量的增加，沙棘果渣总黄酮提取率呈上升趋势（图１），但当酶用量达到沙棘果渣质量的４％后，再增加酶的用量，总黄酮提取率增加幅度不明显，从节约成本、提高提取率的角度考虑，本试验选择生物酶添加量为沙棘果渣质量的４％。

２．２ｐＨ对沙棘果渣总黄酮提取率的影响

酸性或碱性过强，酶的催化作用都会受到抑制。本研究中酶解体系的ｐＨ为５时酶的活性最强，总黄酮提取率最高；ｐＨ小于５时，总黄酮提取率随ｐＨ的升高呈增加趋势；ｐＨ大于５时，总黄酮提取率随ｐＨ的升高减小（图２）。

２．３酶解温度对沙棘果渣总黄酮提取率的影响

沙棘果渣总黄酮提取率先随着温度的升高而增大，在５０ ℃时达到最大值，当温度高于５０ ℃时，黄酮提取率略有下降（图３）。原因可能是生物酶酶解最适温度为５０ ℃，温度过低或过高，酶的活力都降低，从而导致酶解效率受到影响。

２．４酶解时间对沙棘果渣总黄酮提取率的影响

沙棘果渣总黄酮提取率随着酶解时间的延长而增大，但当酶解时间超过１２０ｍｉｎ时，总黄酮提取率随酶解时间的延长增加不显著（图４），故选择酶解时间为１２０ｍｉｎ。

２．５料水质量比对沙棘果渣总黄酮提取率的影响

沙棘果渣总黄酮提取率先随酶解体系中加水量的增加不断增加，当料水质量比为１∶３０时提取率最大，之后再加大水的用量，总黄酮提取率下降（图５），且加水量过大、料水质量比过小会造成成本增加，并给后期浓缩纯化带来不便，所以选择料水质量比为１∶３０。

２．６正交试验结果

正交试验结果见表２，由表２可知，４个因素对沙棘果渣总黄酮提取率影响的大小顺序为酶用量、酶解温度、酶解时间、ｐＨ。生物酶法提取沙棘果渣总黄酮最佳工艺为Ａ３Ｂ２Ｃ３Ｄ２，即酶用量为沙棘果渣质量的４％，ｐＨ５．０，酶解温度６０ ℃，酶解时间１２０ｍｉｎ。

２．７３种沙棘果渣总黄酮提取方法的比较结果

称取相同质量的沙棘果渣样品，分别采用正交试验优化后的生物酶法、超声波法和有机溶剂回流法提取沙棘果渣总黄酮，结果见表３。由表３可知，总黄酮提取率从大到小依次为生物酶法、超声波法、有机溶剂回流法，其中生物酶法提取的总黄酮提取率比有机溶剂回流法和超声波法的提取率分别提高了５１．９１％和４８．５１％，差异显著，且生物酶法和超声波法与有机溶剂回流法相比用时短、操作次数少。因此，生物酶法提取总黄酮提取率高、操作简便，是一种比较理想的提取方法，具有较好的发展前景。

３结论

３．１生物酶法提取沙棘果渣总黄酮工艺的优化结果

生物酶解处理与醇提相结合进行沙棘果渣总黄酮的提取是一种有效的方法，通过单因素试验和正交试验考察酶解体系中各因素对提取率的影响。优化的酶解体系为酶用量占沙棘果渣质量的４％，ｐＨ５．０，酶解温度６０ ℃，酶解时间１２０ｍｉｎ，料水质量比１∶３０。

３．２生物酶法与传统提取方法的比较

对有机溶剂回流法、超声波法与生物酶法进行比较，发现生物酶法比超声波法、常规热回流法提取率明显提高，同时缩短了提取时间，简化了操作步骤，且生物酶法不会造成有机物的残留与污染，因此生物酶法在沙棘果渣总黄酮提取上具有明显优势，这将为沙棘果渣的开发利用提供一种更佳的方法与思路，有较好的发展前景。

参考文献：

［１］齐虹凌，于泽源，李兴国．沙棘研究概述［Ｊ］．沙棘，２００５，１８（２）：３７－４１．

［２］李晓花，孔令学，刘洪章．沙棘有效成分研究进展［Ｊ］．吉林农业大学学报，２００７，２９（２）：１６２－１６７．

［３］孙国志，赵伟．沙棘总黄酮对糖尿病大鼠心肌细胞的影响［Ｊ］．黑龙江医药科学，２０１０，３３（３）：５１－５２．

［４］马惠茹，赵玉娥，郝向阳，等．沙棘护肝作用的研究［Ｊ］．沙棘，２００９，22（２）：３７－３８．

［５］高玲．沙棘化学成分的提取与分离方法研究进展［Ｊ］．赤峰学院学报（自然科学版），２００８（１０）：１７－１９．

［６］张冬雪．水浸提沙棘果渣总黄酮工艺研究［Ｊ］．国际沙棘研究与开发，２００８，６（４）：１０－１３．