超高效液相色谱在中药研究中的应用

2012-04-29杨艳陈旭冰陈光勇刘光明

云南中医中药杂志 2012年6期

杨艳陈旭冰陈光勇刘光明

摘要：目的：综述近年超高效液相色谱（UPLC）在中药研究中的应用。方法：查阅、分析、归纳有关文献。结果：超高效液相色谱是近年来发展的以超高速度、超高分离度、超高灵敏度为特点的新型液相色谱技术。结论：超高效液相色谱为中药研究提供了新手段和新思路，具有广阔的前景。

关键词：超高效液相色谱；UPLC；液相色谱技术；中药；应用

中图分类号：R284

文献标识码：A

文章编号：1007-2349（2012）06-0073-03

超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系指一种采用小颗粒填料色谱柱（粒径小于2μm）和超高压系统（压力大于105kPa）的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。Waters推出的ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统在2003年3月8日~12日举办的匹斯堡展会上一经露面便立即引起了轰动，这项被媒体称为令人“比预想的还要出色”的产品最终获得了2004年度的新产品金奖。2004年3月，Waters公司率先推出了第一台商品化的超高效液相色谱系统（ACQUITY，UPLC TM）。自问世以来，超高效液相色谱发展很快，现已成功应用于农药残留物检测、水质和环境监测、化妆品质量控制、药物及制剂的分析检测和质量控制、中药复杂组分分析及代谢组学等领域［1~2］。现对超高效液相色谱在中药研究中的应用进行综述。

1 在中药提取工艺方面的应用

李耿等［3］使用超高效液相色谱（UPLC），采用析因试验设计，考察了丹参饮片在不同加水倍数、煎煮时间、煎煮次数下的煎出液中丹酚酸B、丹参素、原儿茶醛等多种成分的含量变化规律。实验结果表明随着煎煮时间的延长，丹参中的主要水溶性有效成分丹酚B的含量会而逐步降低；而同时，丹参素和原儿茶醛的含量则持续增加。该研究得出如下结论：丹参酮类成分水煎煮很难溶出，丹参中的丹参素和原儿茶醛主要是来源于丹参酚酸类成分在较高温度下的逐步降解，测定或提取丹参中丹酚B等水溶性成分不宜采用长时间、高温煎煮的方式，丹参临床应用时应注意避免久煎。为今后更好利用丹参这一传统中药提供了很好的科学依据。曹悦等［4］使用UPLC，对中药龙胆的提取工艺进行了研究，该研究采用L9（34）正交表安排实验，Shimadzu C18（30×75 mm，17 μm）色谱柱，流动相为乙腈-04%磷酸（V∶V=55∶945），流速080 mL/min，检测波长235，270 nm，柱温为40 ℃。通过分析正交实验设计法的结果，在使用甲醇作为溶剂、提取时间为30 min时，超声提取和回流提取两种方法所测定的两个指标性成分的含量基本一致，但考虑到回流的操作相对复杂，而且一旦超出规定的回流时间，两类成分含量损失较大，原因是两类成分均为裂环烯醚萜苷类化合物，受热易分解，因此选择了耐用性较好的超声提取方法，并且在操作中严格控制温度。

2 在中药含量测定方面的应用

雷萍等［5］采用UPLC检测法，分离测定了多种虫草产品中腺苷和虫草素的含量。在最优化条件下，以ACQUITY UPLC C18为色谱柱，流动相为乙腈和水，等度洗脱，各组分在4 min内可基本实现基线分离。各组分浓度与峰面积在1~175μg/mL范围内呈良好线性，检测下限（S/N=3）分别为010 μg /mL和012 μg/mL。殷书梅等［6］采用超高压高效液相检测法，测定复方南星止痛膏中马兜铃酸A的含量，在Waters UPLC的高灵敏度色谱条件下，信噪比为3∶1时马兜铃酸A的最低检出限01 μg；3批制剂成品及中间体中均未检出马兜铃酸A；3批细辛药材中检出微量马兜铃酸A，平均含量为196μg/g，推算至每克制剂中含马兜铃酸A约为005μg，远低于口服制剂药品中马兜铃酸A含量不得高05μg/g的标准。唐军等［7］采用超高压高效液相检测法测定血栓通注射液中5种皂苷成分的含量，三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd在95 min内即达到良好分离，最低定量限和最低检测限可分别达05 ng和02 ng，平均回收率均大于950%。此外，超高效液相色谱在中药含量测定方面的研究还有诸多的报道［8~19］。

3 在中药代谢方面的应用

薛璟等［20］采用大鼠在体肠灌流实验，利用UPLC法测定雷公藤甲素的量，分别研究吸收部位和药物浓度对雷公藤甲素吸收的影响。实验结果表明4、83、20 pmol/L雷公藤甲素灌流液在各肠段的有效渗透系数和10 cm肠段吸收百分比（10 cm% ABS）依次为：十二指肠>结肠>空肠>回肠，各肠段之间无显著性差异（P>005）。不同质量浓度（4～20 μmol/L）的雷公藤甲素在肠道内的吸收无显著性差异（P>005）。潘坚扬等［21］采用UPLC-MS/MS分析方法测定大鼠灌胃给药和静脉给予丹参素后不同时间点的血药浓度，进而研究丹参素在大鼠体内的药动学特征及口服生物利用度。实验结果表明，丹参素的口服生物利用度为953%，口服生物利用度较差，其半衰期无明显差异。徐丽等［22］利用大鼠在体小肠灌流技术，UPLC-MASS测定大戟95%醇提物，大戟95%醇提物与大枣水提物混合溶液随灌流时间的变化。实验排除了部分与解毒减毒作用无关的成分，将发生变化的成分归类，缩小了寻找毒性成分的范围，降低了盲目性，为更深层次的研究奠定了基础。

4 在中药指纹图谱方面的研究

李存满等［23~24］利用UPLC，对不同产地白花蛇舌草及其伪品水线草的总提物及其非强极性组分特征图谱进行相似度考察和主成分分析，实验结果表明，不同产地白花蛇舌草原药材包括对照药材利用总提物特征图谱进行分析，尽管能得到一定的聚类效果，但并不是很明显。而将其中的强极性组分有效去除，再对非强极性组分进行特征图谱统计分析时，不同产地不同品种的原药材聚类效果很好。叶文文等［25］利用UPLC，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（10 mm×50 mm，17μm），乙腈-水二元梯度洗脱模式，流速为01 ml?min-1，紫外检测波长42 nm，建立了32 批不同产地白术样品的UPLC指纹图谱。白术药材有32个共有峰，多数峰可达到较好的分离，各批次白术药材间共有峰的相对保留时间RSD均<10%，药材间相似度均>90%。刘少华等［26］利用超高效液相色谱对12批陕西商洛药材基地产丹参药材进行测定，标定共有峰，并通过国家药典指纹图谱相似度计算软件中“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”，计算出其相似度均在095以上。刘梅等［27］利用UPLC，建立丹参药材中水溶性成分丹酚酸类和脂溶性成分丹参酮类的UPLC指纹图谱方法，在15min内得到丹参药材水溶性和脂溶性成分的指纹图谱，峰容量85。并采用液质连用技术（HPLC-DAD-ESI/MSn）鉴定了其中的20个特征峰，适合于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制。汤芳玲等［28］利用UPLC，通过检测10 批小叶黑柴胡药材，建立其UPLC指纹图谱，共标定了28个共有指纹峰，根据聚类分析结果，可将药材质量分为2大类，8个相似度较高的药材分为一类，相异度高的2、5号药材分为另一类。该方法稳定、重复性好，可用于小叶黑柴胡药材的质量控制。

5 结语

UPLC作为一种新型液相色谱技术，延伸了液相色谱的应用范围。UPLC以超强分离能力和速度、超高灵敏度、与HPLC简单方便的方法转换、良好的质谱入口等特点为现代色谱分析开创了广阔的前景。其进样体积小，分离快，溶剂消耗少，为药物化学成分分析、药物合成分析、中药快速定性定量分析和体内代谢产物分析，提供了一种高效、准确的分析技术。充分利用UPLC的高分离效率和 MS的高灵敏度与定性功能，能快速完成众多复杂成分的分离与鉴定。该联用技术既可建立中药或复方药物指纹图谱，又可进行多种有效成分或指标成分定量，还可用于体内药物分析。随着药物分析方法的发展，UPLC作为一种强有力的分析技术，将会在中药研究领域中发挥越来越重要的作用［1］。

参考文献：

［1］郝桂明，唐素芳背高效液相色谱在药物分析中的应用［J］.天津药学，2009，21（6）：64~69

［2］赵明霞，胡基埂，吴方千，等背高压液相色谱系统的研究进展［J］.分析试验室，2009，28（Suppl保：137~140

［3］李耿，于长安，李振坤，等钡げ渭逯蠡学成分溶出规律研究［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15（8）：46~46

［4］曹悦，左代英，王维宁，等绷胆药材提取工艺的正交实验设计法优选［J］.时珍国医国药，2009，20（9）：2264~2265

［5］雷萍，黄志英，林淼，等背娌莶品中腺苷和虫草素含量的测定-UPL检测［J］.食用菌学报，2009，19（3）：63~66

［6］殷书梅，王宓，林新艳，等盪PLC法测定复方南星止痛膏中马兜铃酸A的含量［J］.南京中医药大学学报，2009，25（5）：396~397

［7］唐军，武为宝背高效液相色谱法快速测定血栓通注射液中5种皂苷成分的含量［J］.药物分析杂志，2008，28（1）：97~99

［8］王文辉，杨俊，王齐，等盪PLC法测定萝芙木根中的利血平含量［J］.光谱实验室，2009，26（4）：855~857

［9］杨立伟，郑传奇，蒋忠军，等背高效液相色谱法测定西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量［J］.中药材，2008，31（1）：55~57

［10］杨筱丽，李耿背高效液相色谱法同时测定解郁丸中芍药苷和阿魏酸的含量［J］.中国医院药学杂志，2008，28（11）：946~947

［11］刘正聪，陆舍铭，王海利，等背高效液相色谱法测定天然原料中的香豆素含量［J］.香料香精化妆品，2009，8（4）：27~29