有关“单克隆抗体制备”的几点释疑

李颖

摘要：“单克隆抗体的制备”是高中生物选修三的一个难点。笔者通过深挖教材，对教材中没有解释清楚的几个疑点做了阐释，同时构建了逻辑更为合理的单克隆抗体流程图供大家参考。

关键词：单克隆抗体；杂交瘤细胞；选择性培养基

中图分类号：G633.91 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2012）09-0204-02

“单克隆抗体的制备”是高中生物人教版选修3专题2第二节“动物细胞工程”一节的重点和难点。内容相对复杂、抽象，加上教材对部分环节处理得很简练，学生理解起来难度很大，难免产生这样或那样的疑问。笔者通过对教材的研究及教学的反思，将教学过程中学生提出的问题及课本中应挖掘和拓展的知识总结如下：

1 教材中需要挖掘和总结的知识

1.1什么是单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody）：是指利用一个B淋巴细胞进行无性增殖，产生大量的同一种类的B淋巴细胞群，再由这个细胞群产生出化学性质单一、特异性强的抗体。多克隆抗体（polyclonal antibody）：当肌体受到抗原刺激后，可产生新的抗体。抗原分子的决定簇直接决定了抗体的特异性的存在，同时也内含着大量的原决定簇。所以，经过他免疫所缠身的抗血清实就是多种抗体的混合物，我们习惯性地把这个称为克隆抗体。

1.2单克隆抗体制备的原理是什么。动物在免疫反应的过程中，各种B淋巴细胞都可以分泌出特有的特异性抗体，为了大量地获得，就必须最大限度地增加增殖这些单一抗体。而且众所周知，B淋巴细胞可以产生一种能力，叫做单一抗体，但是他的局限是不能够完成体外增殖；但是骨髓瘤细胞却可以在外界限定条件下被无限地增殖，更为可怕的是它是癌细胞，还好没有产生抗体的能力。所以大胆试验，把二者合为一体进行细胞融合，产生新细胞，这种细胞兼具双特性——在特定条件下，可以产生大量某种特异抗体，却不会出现增殖现象。

1.3从小鼠脾脏中获取的B淋巴细胞是指哪类细胞？是否是一种淋巴细胞？从小鼠脾脏中取出的能产生抗体的B淋巴细胞指的是浆细胞（效应B细胞）。但是在在免疫的实际操作中，我们采用的方法是连续注射抗原，由于每一次注射的抗原不同，而一种抗原特定簇只能形成相对应的一种B淋巴细胞。所以，提取的B淋巴细胞也有着各不相同的特异性。

1.4B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后获得哪些类型细胞。在制备杂交瘤细胞这一步骤中，培养液中共含5种主要细胞，即未融合的B淋巴细胞、未融合的骨髓瘤细胞、B淋巴细胞-B淋巴细胞融合细胞、骨髓瘤-骨髓瘤融合细胞和B淋巴细胞-骨髓瘤细胞融合细胞（杂交瘤细胞）。

2 教材中相关知识的拓展

2.1如何利用特定的选择性培养基筛选出杂交瘤细胞。第一次筛选的关键在于细胞融合后，如何选择培养杂交瘤细胞。我们有两种方法可以合成细胞中的DNA。第一条途径“D途径”，也就是用氨基蝶呤来直接阻断DNA的合成的一种极端方法。第二条途径适合使用在紧急情况下，也被叫做“S途径”。也正是以此为根据，我们在配置HAT选择性培养液的时候会定量放入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。这其中的未融合的B淋巴细胞和两个B淋巴细胞融合的“D途径”氨基蝶呤阻断，导致其短期死亡。就算“S途径”正常，也因其缺乏体外培养增殖的能力而死亡。再说骨髓瘤细胞及其自身的融合细胞，属于HGPRT细胞，自身没有“S途径”，同时“D途径”又被阻断，导致HAT在培养液中迅速死亡。只剩下杂交瘤细胞，在拥有“S途径”的同时，也可以在培养液中长期增殖，所以能选择存活下来然后不断增殖并不稀奇。

2.2杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养过程解析。杂交瘤细胞克隆化培养就是：在融合后的细胞经过选择性培养后，那些能够存活下来的细胞就是杂交瘤细胞。然后用“有限稀释法”来选择出这些杂交瘤细胞是否是能分泌出所需抗体的类型。接下来就是培养过程，先将杂交瘤细胞稀释，严格限制每空细胞不能超过一个，用多孔细胞培养板进行培养，并观察其不断地增殖。过一段时间观察是否出现阳性孔，阳性孔是各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔。由于阳性孔自身的特性所限，必须进行3到4次的有限稀释才能够保证每个培养孔的增殖的细胞为单克隆细胞。至此，克隆化培养才算结束。

2.3为什么获得预定的杂交瘤细胞后，要尽快进行单克隆抗体制备。实验中，融合细胞会随着培养时间延长发生污染、染色体丢失以及细胞死亡率增加等现象，因此，一旦获得能产生预定特异性抗体的杂交瘤细胞株，就应尽早地进行单克隆抗体制备。

2.4单克隆抗体获取的途径是什么。大量生产单克隆抗体的方法可分为体内和体外两大类，目前以体内法为主。

体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞合成并分泌单克隆抗体，收集上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。

体内培养法：往小鼠体内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。用注射器抽取腹水，提取单克隆抗体。

2.5获得的单克隆抗体为什么还要进一步纯化。无论是体内还是体外培养获得的单克隆抗体都必须进一步纯化，因为单克隆抗体上仍有可能带有鼠的抗原决定簇，患者有可能产生针对于单克隆抗体的抗体，出现交叉反应。单抗纯化有三种比较常见技术：1.DEAE离子交换层析柱；2.凝胶过滤法；3.亲和层析法。我们应该根据实验中的实际情况来选择合适的方法，而不是按照课本，一步步照搬而来。

为了方便读者更好地理解文中的内容，笔者绘制了单克隆抗体的制备流程图，仅供参考。

参考文献：

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