CTX对2型糖尿病肾病的治疗作用

张亚莉， 姜莎莎， 李 燕， 冯 婕， 谭 峰， 孙吉平， 严骏飞 (西安交通大学医学院第一附属医院肾病医院肾内科， 西安 710061)

随着我国社会经济持续发展，人民生活水平的迅速提高、生活方式的改变以及社会人口的老龄化，近几年我国糖尿病的患病率呈急剧增加趋势。中国已跃居糖尿病第一大国，而且发病年龄趋于年轻化［1］。糖尿病肾病的主要特点是以肾小球、肾小血管硬化为主要表现的糖尿病的慢性并发症，目前在慢性肾功不全的透析患者中，糖尿病肾病已占第二位，严重地危害着人类的健康。蛋白尿(包括微量蛋白尿)是导致肾脏疾病发展到终末期的主要因素，同时使心血管疾病死亡风险及全因死亡风险显著增加［2］。因此寻找新型治疗方法具有至关重要的作用，本文旨在探讨环磷酰胺对糖尿病肾病的治疗作用。

图1 三组大鼠肾组织的HE染色光镜下的病理改变(×400)Fig 1 Pathological changes of renal specimen in three groups by HE staining(×400)

图2 三组大鼠肾组织的Masson染色光镜下的病理改变(×400)Fig 2 Pathological changes of renal specimen in three groups by Masson staining(×400)

图3 三组大鼠肾组织的PAS染色光镜下的病理改变(×400)Fig 3 Pathological changes of renal specimen in three groups by PAS staining(×400)

1 材料与方法

1.1 动物与材料 刚断乳3周龄的Sprague-Dawely雄性大鼠SPF级，80只，体重35－55 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供，糖尿病肾病造模用的链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)由美国Sigma化学公司生产，注射用环磷酰胺(CTX)由江苏恒瑞医药股份有限公词，产品批号:11112821。各项实验室指标均由我院中心实验室完成检测。

1.2 分组及方法 80只大鼠适应性喂养1周，测血糖正常，随机分为2组:对照组(N组)14只，高脂饮食组(HF组)66只。

1.3 糖尿病肾病动物模型的建立及评估 N组每日给予常规饲料，HF组每日给予高脂饲料喂养。大鼠自由进食和饮水。8周后，N组及HF组各随机抽取6只，行葡萄糖耐量实验(OGTT)及同步胰岛素释放试验，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)［3］。证实HF组存在胰岛素抵抗后，第10周末，所有大鼠禁食不禁水12 h，HF组一次性腹腔注射STZ(35 mg/kg)，对照组腹腔注射等量的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液。给予STZ后3 d，7 d，14 d分别行尾静脉采血测随机血糖，以随机血糖值＞15.0 mmol/L为2型糖尿病模型制备成功标准［4］，HF组中共54只成模，余12只未成模者舍弃。第12周末将HF组大鼠及N组大鼠置于代谢笼中，收集尿液测24 h尿蛋白定量，经统计学分析，若糖尿病模型大鼠较正常组的测定值高，差异有统计学意义即表明糖尿病肾病模型制备成功，之后所有大鼠均给予常规饲料喂养。将造模成功的大鼠再随机分为两组，糖尿病肾病模型组(DN组)18只及环磷酰胺治疗组(CTX组)36只。治疗组给予环磷酰胺(CTX)30 mg/kg腹腔注射，N组及DN组等量的生理盐水腹腔注射。各组动物按上述方案干预，每周一次，连续4周。每周测一次体重，每2周测一次随机血糖。整个实验过程中均不给予胰岛素治疗，无动物意外死亡。

1.4 标本的收集 实验结束前1 d，即第17周末，将大鼠放入代谢笼中，收集24 h尿液，测24 h尿蛋白定量;称体重后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml/100 g麻醉大鼠，心尖部取血，离心分离血清，进行尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)的测定。4℃生理盐水原位灌洗后迅速摘除左侧肾脏，去包膜，生理盐水冲洗后称肾重，计算肾脏肥大指数(kidney hypertrophy index，KHI)，将肾标本切成约 1.0 cm ×0.5 cm ×0.5 cm大小的组织块，10%福尔马林固定，石蜡包埋，常规连续切片，做普通肾脏病理学检查(HE、Masson、PAS)及免疫组织化学染色。

1.5 统计学的处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料用±s表示，对非正态分布计量资料用中位数及四分位数间距表示;对各对比组观察值进行正态性和方差齐性检验，若满足正态性和方差齐性，使用随机设计资料的方差分析方法，两两比较使用LSD-t检验，若不满足，使用 K-W秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 HF组与N组组大鼠随机分组后的体重分别是(45.50 ±6.41)g和(49.00 ±4.80)g，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明两组的大鼠基本条件一致。

2.2 高脂喂养8周后HF组与N组糖耐量及胰岛素水平比较 两组大鼠8周时的血糖值差异无统计学意义(P＞0.05)，而胰岛素水平、胰岛素抵抗指数差异有统计学意义(P＜0.05)，表明经高脂饮食大鼠诱导出胰岛素抵抗，即高脂饮食组需分泌较多的胰岛素来维持与正常组相当的血糖水平(见表1)。

表1 两组大鼠血糖及胰岛素比较(±s)Tab 1Comparison of blood sugar and insulin between two groups(±s)

表1 两组大鼠血糖及胰岛素比较(±s)Tab 1Comparison of blood sugar and insulin between two groups(±s)

与N组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹血糖(FBG)×对应的空腹胰岛素水平(FINs)/22.5

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2.3 注射STZ后HF组与N组化验指标比较 注射STZ后不同时间点HF组的血糖及尿蛋白定量均高于N组，差异具有统计学意义，提示糖尿病肾病造模成功(见表2)。

表2 两组大鼠临床生化指标比较Tab 2 Comparison of biochemical indicators between normal rats and DN rats

2.4 注射环磷酰胺治疗后化验指标比较 治疗组给予CTX 4周后，测三组大鼠24 h尿蛋白定量，DN组和CTX组均高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明模型组和治疗组符合糖尿病肾病的筛选标准;CTX组尿蛋白定量低于DN组，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示CTX治疗能够减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿，降低达 17.84%［(54.65 －44.90)/54.65)］。尿素氮及肌酐方面，DN组较其他两组高，CTX组的尿素氮高于正常组(P＜0.05)，肌酐在CTX组与正常组间差异无统计学意义(P＞0.05，见表3)。

2.5 肾脏肥大指数的比较 第17周末，摘取大鼠左侧肾脏后，称肾重，计算肾脏肥大指数(KHI)，可见DN组和CTX组大鼠KHI高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)，而DN组与CTX组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明糖尿病肾病大鼠KHI高于正常大鼠，CTX治疗对改善糖尿病肾病大鼠KHI无作用(见表4)。

表3 治疗后三组化验指标比较Tab 3 Comparison of chemical markers after treatment among three groups

表4 不同组别肾脏肥大指数的比较(±s)Tab 4Comparison of KHI among three groups(±s)

表4 不同组别肾脏肥大指数的比较(±s)Tab 4Comparison of KHI among three groups(±s)

方差分析，与正常组比较，＊＊P＜0.01

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2.6 肾脏病理比较 HE染色、Masson染色、PAS染色:光镜下对照组大鼠肾组织结构正常，毛细血管襻开放良好，基底膜无增厚，系膜基质无增多。糖尿病肾病模型组可见肾小球系膜细胞增生，肾小球基膜增厚，足细胞增生，间质有炎性细胞浸润、间质纤维化严重，肾小球系膜区PAS阳性物质沉积，呈不均匀的红染。Masson肾小管内可见颗粒沉积及空泡变性，肾间质增多。治疗组病理改变较肾病组明显减轻(图1－3，见第636，637 页)。

3 讨论

近几年糖尿病的发病率明显增多，已成为全球公共卫生难题之一，严重危害人类的健康［5］。2008年5月完成的全国糖尿病和代谢疾病研究(The China National Diabetes and Metabolic Disorders Study)显示，中国已经跃居全球糖尿病第一大国［1］。糖尿病是一种严重的慢性、进展性疾病，相当一部分患者到后期可能会出现糖尿病的各种慢性并发症如糖尿病心脏病、脑卒中、失明、肾衰和截肢等相关并发症。1型糖尿病约15% －25%出现糖尿病肾病，而2型糖尿病肾病发病率高达30%－40%。目前治疗糖尿病肾病的主要方法包括降糖、降压、调节脂质异常等，尽管这些治疗部分能延缓糖尿病肾病的进展，但仍有很大比例患者最终出现慢性肾功能衰竭，目前糖尿病肾病是导致终末期肾衰的最重要原因之一。因此寻找新型治疗方法减少糖尿病肾病的发生或延缓发展至终末期肾衰具有至关重要的意义。

糖尿病肾病发病机制比较复杂，已经证明糖基化作用、生长因子/细胞因子、血液动力学改变、细胞内改变等均参与糖尿病肾病的发病机制。近几年有报道糖尿病的发病过程中存在着免疫因素的参与，在免疫组织化学染色可见IgG弥漫性分布于肾小球基底膜及肾小管基膜，有时可见IgM或C3沉积。在糖尿病肾病患者体内有更明显的炎症反应。炎症因素在糖尿病肾病的发病中的作用受到越来越多学者的重视。肾脏的固有细胞在病理状态下可以产生肿瘤坏死因子 － α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素－1(interleukin-1，IL-1)，白细胞介素－6(interleukin-6，IL-6)，一氧化氮(nitric oxide，NO)等多种炎症因子，这些因子又通过自分泌和旁分泌的方式使炎症效应不断扩大，从而引起炎症级联反应。已经证实糖尿病肾病模型肾组织中存在CD4+和CD8+T细胞浸润，肾脏中淋巴细胞浸润和组织损伤仅在糖尿病出现之后才发生。STZ诱导的糖尿病模型组8周时ED-1+巨噬细胞在肾小球浸润，肾小球内IL-1较对照组升高2.8倍，TNF-α表达较对照组高3.8倍。1型糖尿病患者肾病的存在与活化的外周血T细胞增加有关。这些研究结果均提示淋巴细胞及炎性细胞因子参与糖尿病肾病的发病过程［6－8］。

最近有学者提出把糖尿病肾病看作是一种由靶代谢和免疫联系起来的炎症性疾病。糖尿病肾病进行性发展与进展，受很多因素的影响，如血糖、血压、血脂，蛋白尿的影响特别大，既会损伤肾小球也会损伤肾小管，又会引起严重的低白蛋白血症，使患者抵抗力严重低下易招致感染而出现一系列严重的问题，因此减少糖尿病肾病患者的蛋白尿，在一定程度上就能保护肾脏、延缓肾脏损伤的进展，延长需要透析的时间。近来越来越多的研究发现，对于2型糖尿病患者微量蛋白尿不仅是早期糖尿病肾病的标志，也是心血管疾病的危险因素［3］，甚至其与心血管疾病的关联性更强［2］。

环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)，为氮芥与磷酰胺基结合而成的化合物，是临床常用的烷化剂类免疫抑制，早在20世纪60年代，CTX就用于肾病综合征的治疗。由于它具有经济、应用方便、疗效较好、副作用相对较小的特点，目前在国内广泛应用于治疗肾病。环磷酰胺能够作用于免疫系统定向的干细胞，抑制细胞的分化、增殖，杀死有丝分裂和进入循环周期的细胞，抑制机体的免疫反应［9，10］，因此广泛用于有炎症及免疫反应参与的相关疾病。多项研究表明，炎症能加快DN进展，抗炎治疗能减慢DN进展［11］，因此推测环磷酰胺可通过抑制糖尿病肾病的炎症及免疫反应，而达到治疗作用，目前有关环磷酰胺对糖尿病肾病治疗作用的报道很少。

本研究是为了探讨免疫抑制剂(环磷酰胺)对2型糖尿病肾病的尿蛋白治疗作用。研究结果提示，腹腔注射STZ后14 d，HF组与N组血糖、尿蛋白定量比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示糖尿病肾病造模成功，给造模成功的大鼠环磷酰胺治疗4周，治疗组的尿蛋白定量较模型对照组(DN)明显降低，但仍较正常对照组(N组)高。对肾功能的影响，DN组尿素氮和肌酐较其他两组高。CTX组的尿素氮高于N组(P＜0.05)，肌酐在CTX组与N组间无差异(P＞0.05)。肾病病理变化，对照组大鼠肾组织结构正常，毛细血管襻开放良好，基底膜无增厚，系膜基质无增多。糖尿病肾病模型组可见肾小球系膜细胞增生，肾小球基膜增厚，足细胞增生，间质有炎性细胞浸润、间质纤维化严重，肾小球系膜区PAS阳性物质沉积，呈不均匀的红染。Masson肾小管内可见颗粒沉积及空泡变性，肾间质增多。治疗组病理改变较肾病组明显减轻，但与对照组比较仍有病变存在。结果提示，造模成功的大鼠存在肾脏病理学的改变、肾功能的损害。经环磷酰胺治疗后尿蛋白明显减少、肾功能损害及病理改变均减轻，但仍未恢复正常，推测其原因可能与治疗时间短或有部分病变属高血糖等一些非免疫因素所致有关，因本研究是为了解环磷酰胺的治疗作用，未使用胰岛素，如要进一步确定其长期疗效，需延长治疗及观察时间。

总之，研究结果提示，环磷酰胺治疗可以使STZ诱导的2型糖尿病肾病大鼠尿蛋白减少，减低达17.84%，并能减轻肾功能的损害及肾脏的病理改变，但要在临床广泛推广使用还需要进一步的大量研究证实。

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