脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T与老年非糖尿病冠心病的相关性

史凯蕾, 朱 毅, 缪应新, 郭新贵



脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T与老年非糖尿病冠心病的相关性

史凯蕾1*, 朱 毅1, 缪应新2, 郭新贵1

（复旦大学附属华东医院:1心血管内科,2中心实验室, 上海 200040）

探讨老年人脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T与老年非糖尿病冠心病的相关性。选择2005年11月至2009年12月入住我院心血管内科病房, 行冠状动脉造影、年龄≥65岁的非糖尿病患者688例, 根据冠状动脉造影结果分为冠心病组396例和对照组292例。采用聚合酶链式反应/连接酶检测反应方法检测多态性位点。SNPs＋45T＞G基因表型为突变型GG者发生冠心病的危险性较TT型者显著增加（OR = 2.65,＜0.01）; SNPs＋276G＞T基因表型为GG型者发生冠心病的危险性较TT型者显著增加（OR = 2.36,＜0.01）; 杂合子GT型者发生冠心病的危险性也较TT型者显著增加（OR = 1.66,＜0.05）。logistic回归分析显示, SNPs＋45T＞G基因表型为GG型, SNPs＋276G＞T基因表型为GG和GT型是冠心病发病独立的危险因素。SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T位点存在连锁不平衡, 脂联素基因SNPs＋45T＞G基因表型为突变型GG型者SNPs＋276G＞T基因表型均为GG型, 而SNPs＋276G＞T基因表型为突变型TT型者SNPs＋45T＞G基因表型均为TT型, 即GGGG基因表型和TTTT基因表型, 且SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T位点基因表型为GGGG型者发生冠心病的危险性显著高于TTTT型者（OR = 4.77,＜0.01）。在老年非糖尿病者中, 脂联素基因SNPs＋45T＞G基因表型为GG型者和SNPs＋276G＞T基因表型为GG或GT型者可能是冠心病的易感人群。

脂联素; 单核苷酸基因多态性; 冠心病; 老年人

脂联素是脂肪细胞特异分泌的一种蛋白质,由244个氨基酸构成,在人血浆中含量丰富,约占总血浆蛋白质的0.01%[1]。实验证据显示脂联素与动脉粥样硬化具有明显的相关性,血清脂联素水平降低与动脉粥样硬化损伤的严重性密切相关,低脂联素血症是冠心病独立的危险因素[2,3]。编码脂联素的基因位于染色体3q27,包括3个外显子和2个内含子。全基因组扫描及相关研究推测该染色体区域为心血管疾病、糖尿病、代谢综合征的易感位点[4-6]。正常人脂联素基因中存在相当数量的等位基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）,脂联素外显子2的SNPs＋45T＞G和内含子2的SNPs＋276G＞T被证实与糖尿病、代谢综合征的发病有关[7,8],而关于脂联素这两个位点SNPs与冠心病关系的研究结果却不尽相同。一方面汝颖等[9]研究发现, 脂联素基因SNPs＋276G＞T基因型GG＋G/T与TT相比,患冠心病的风险比值明显上升（OR = 2.976）;另一方面Jung等[10]的研究则显示, 脂联素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T多态性与冠心病发病无关。

目前文献中尚无关于65岁以上老年人脂联素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T与冠心病相关性的报道。本文对老年非糖尿病冠心病患者脂联素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T基因表型分布情况进行了观察,旨在探讨其与冠心病发病的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象

入选对象为2005年11月至2009年12月在我院心血管内科住院行冠状动脉造影,年龄≥65岁的患者,共688例。排除标准:糖尿病、心肌病、瓣膜病、严重肝、肾功能不全;各种急慢性感染性疾病、肿瘤患者;6个月内有脑卒中史;自身免疫性疾病患者。其中男性507例,女性181例,平均年龄（73.76±6.58）岁。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料采集 由专人负责测量身高、体重、坐位血压,计算体质量指数（body mass index,BMI）= 体重/身高2（kg/m2）。心血管内科专科医师于入院当日收集患者既往病史。选择性冠状动脉造影检查使用西门子Axiom 100数字减影机,由心脏内科专业医师操作,选择常规投照体位观察冠状动脉病变,分别对左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉及其一级分支病变狭窄程度进行评价。

1.2.2 分组标准 根据美国心脏病学会所规定的冠状动脉血管图像记录分段评价标准,应用计算机软件定量冠脉造影对内径≥2.5 mm的主要冠状动脉（左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉）进行测量,有一支主要血管狭窄直径≥50%判断为冠心病。根据冠状动脉造影结果,在所有入选病例中,冠心病组为396例,对照组为292例。

1.2.3 脂联素基因SNPs检测 每位研究对象抽取1 ml静脉血（EDTA抗凝）,采用介质纯化法提取白细胞DNA（生工生物工程技术服务有限公司,上海）,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增包含SNPs＋276G＞T多态位点的脂联素DNA片断,用连接酶检测反应（ligase detection reaction,LDR）检测PCR产物,从而识别多态性位点。用生物学软件Primer 3设计引物,上游引物5′-GTCTCTCCTTGGCTGACAGTG-3′;下游引物:5′-AATCATTCAGGTTGCTTATGGTTA-3′。PCR反应体系为20 µl,95℃预变性15 min;94℃变性30s,60℃退火90 s,72℃延伸30 s,共35个循环;末次72℃延伸10 min,PCR产物长度为400 bp,PCR产物采用3%琼脂糖凝胶电泳检验。根据LDR探针设计原则设计LDR的上下游探针。上游探针5′端采用磷酸化修饰,3′端采用荧光标记（表1）。LDR反应体系为10 µl,95℃预变性2 min;94℃变性30 s, 60℃退火2 min,共35个循环。LDR产物在Abi Prism 377测序仪下测序。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0软件进行统计分析, 计算Hardy- Weinberg平衡以判断样本的群体代表性。实验数据中计量资料用均数±标准差表示。两组间比较采用检验;多组间比较采用ANOVA方差分析;基因型的分布频率比较用χ检验和logistic回归分析。＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 LDR反应探针序列(5′～3′)

2 结 果

2.1 一般情况

两组间一般情况比较见表2,冠心病组和对照组在年龄、性别、BMI、高血压史、高脂血症史等方面均衡可比（＞0.05）;冠心病组吸烟者多于对照组（＜0.01）。

表2 各组一般情况比较

注: BMI: 体质量指数。与对照组比较,**＜0.01

2.2 基因表型分析

PCR产物长度为400 bp,包含研究所涉及的SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点。PCR扩增产物与LDR探针杂交,在连接酶作用下形成含荧光标记的LDR产物。脂联素基因SNPs＋45T＞G为纯合子TT型时,经测序仪测得长度为82bp的片断;基因表型为杂合子T/G型时,测得82 bp和85 bp的两个片段;基因表型为纯合子GG型,则测得85 bp的片断。688例研究对象中,TT型为399例,T/G型为244例,GG型为45例,以Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,基因型分布符合遗传平衡,其基因频率分布具群体代表性（χ= 0.86,＞0.05）。

脂联素基因SNPs＋276G＞T基因表型为纯合子GG型时,经测序仪测得长度为88 bp的片段;基因表型为杂合子G/T型时,测得88 bp和91 bp的两个片段;如为纯合子TT型,则测得91 bp的片断。688例研究对象中,GG型为328例,G/T型为282例,TT型为78例,以Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验,基因型分布符合遗传平衡,其基因频率分布具群体代表性（χ= 2.12,＞0.05）。

2.3 冠心病组和对照组脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T基因型比较

脂联素基因SNPs＋45T＞G,冠心病组396例患者中TT型为227/396（57.4%）,T/G型为134/396（33.8%）,GG型为35/396（8.8%）;对照组292例患者中TT型为172/292（58.9%）,T/G型为110/292（37.7%）,GG型为10/292（3.4%）, 两组比较差异有统计学意义（＜0.05）。

脂联素基因SNPs＋276G＞T,冠心病组396例患者中GG型为208/396（52.5%）,G/T型为155/396（39.1%）,TT型为33/396（8.3%）;对照组292例患者中GG型为120/292（41.1%）,G/T型为127/292（43.5%）,TT型为45/292（15.4%）,两组比较差异有统计学意义（＜0.01）。

2.4 脂联素基因多态性与冠心病相关性分析

以分类变量冠心病作为因变量,以脂联素SNPs＋45T＞G基因型作为自变量进行风险因素分析,SNPs＋45T＞G基因表型为突变型GG者发生冠心病的危险性较具有TT型者显著增加（OR = 2.65,95%CI 1.208～5.504;＜0.01）;杂合子TG型者与TT型者比较差异无统计学意义（OR = 0.923,95%CI 0.670～1.272;＞0.05）。等位基因G与T相比冠心病的危险性无明显增加（＞0.05）。

以分类变量冠心病作为因变量,以脂联素SNPs＋276G＞T基因型作为自变量进行风险因素分析,SNPs＋276G＞T基因表型为GG型者发生冠心病的危险性较具有TT型者显著增加（OR = 2.36,95%CI 1.430～3.906;＜0.01）;杂合子GT型者发生冠心病的危险性也较具有TT型者显著增加（OR = 1.66,95%CI 1.003～2.763;＜0.05）。等位基因G与T相比冠心病的危险性显著增加（＜0.01）。将GG和GT基因型合并统计后发现,至少携带一个G等位基因者患冠心病的危险性仍增高（OR = 2.004,95%CI 1.243～3.230;＜0.01）。

2.5 连锁不平衡分析

本研究还发现,脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点的基因表型存在连锁不平衡。脂联素基因SNPs＋45T＞G基因表型为突变型GG型者SNPs＋276G＞T基因表型均为GG型;而SNPs＋276G＞T基因表型为突变型TT型者SNPs＋45T＞G基因表型均为TT型。冠心病组脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点的基因表型为GGGG型者较对照组显著增多,相对于脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点基因表型为TTTT型者,脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点的基因表型为GGGG型者,发生冠心病的危险性显著增高（OR = 4.77,95%CI 2.07～10.99;＜0.01）。

2.6 logistic回归分析冠心病独立危险因素

以冠心病为因变量（是= 1,否= 0）,年龄（连续变量）,性别（男= 1,女= 0）,BMI（连续变量）,高脂血症（是= 1,否= 0）,吸烟（是= 1,否= 0）,SNPs＋45T＞G基因表型为GG型（是= 1,否= 0）,SNPs＋276G＞T基因表型为GG型和GT型（是=1,否= 0）为自变量,进行logistic回归分析,最后进入模型的变量为吸烟、SNPs＋45T＞G基因表型为GG型、SNPs＋276G＞T基因表型为GG型和GT型,提示SNPs＋45T＞G基因表型为GG型、SNPs＋276G＞T基因表型为GG型和GT型为冠心病独立的危险因素（表3）。

表3 logistic回归分析冠心病独立危险因素

注: 第1步回归变量: 年龄、性别、BMI、高血压、高血脂、吸烟、SNP45GG, SNP276GG, SNP276GT。*＜0.05

3 讨 论

脂联素与胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管疾病密切相关。脂联素可以通过抗炎、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、改善胰岛素抵抗等发挥心血管保护作用。脂联素基因位于染色体3q27上,全基因组扫描证实, 该区域存在代谢综合征和冠心病的易感位点,因而此区域的基因突变可能与冠心病有相关性。以往关于脂联素基因多态性与冠心病相关性的研究多集中于普通冠心病或冠心病合并糖尿病人群,因此大多混杂了糖尿病这个冠心病重要的危险因素[11,12]。

冠心病是一个多因素疾病,遗传因素、环境因素等共同作用导致疾病的发生。糖尿病是冠心病重要的易患因素之一,排除糖尿病的作用更有利于分析遗传因素对老年冠心病的影响。本课题首次对老年非糖尿病者脂联素SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T多态性对冠心病的影响作了研究,结果显示,在老年非糖尿病患者中,脂联素SNPs＋45T＞G基因表型为突变型GG型者发生冠心病的危险性高于TT型（OR = 2.65）,提示突变型GG基因表型可能为冠心病易感人群,这个结果与王珺楠[13]及Sabouri等[14]的研究结果一致。陆峰等[15]研究发现, 南京地区非2型糖尿病冠心病患者脂联素SNPs＋276G＞T与冠心病发病相关,GG型可能是冠心病易感基因。在我们的研究中,脂联素SNPs＋276G＞T基因表型为GG型者发生冠心病的危险性高于突变型TT型（OR = 2.36）;基因表型为GT型者虽发生冠心病的危险性低于GG型,但仍高于TT型（OR = 1.66）;携带至少一个G等位基因（GG或GT型）者冠心病的危险性高于TT型者（OR = 2.00）,提示突变型TT型可能为具有保护作用的冠心病基因表型,该结果与陆峰等[15]的报道相符。Logistic回归分析显示,在考虑了年龄、性别、高血压、高脂血症、吸烟等冠心病常见的易患因素后,SNPs＋45T＞G 基因表型为GG型、SNPs＋276G＞T基因表型为GG型和GT型仍然是冠心病发病独立的危险因素。由此可见,在老年非糖尿病患者中,脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T与冠心病的发生存在一定的相关性。

我们的研究还发现,脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T存在连锁不平衡,脂联素基因SNPs＋45T＞G基因表型为突变型GG型者SNPs＋276G＞T基因表型均为GG型;而SNPs＋276G＞T基因表型为突变型TT型者SNPs＋45T＞G基因表型均为TT型。进一步统计分析显示,冠心病组脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点的基因表型为GGGG型者发生冠心病的危险性显著高于TTTT型者（OR = 4.77,95%CI 2.07～10.99）提示脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T两个位点的基因表型为GGGG型者可能是冠心病的易感人群。

综上所述,在老年非糖尿病者中,脂联素基因SNPs＋45T＞G基因表型为GG型者,SNPs＋276G＞T基因表型为GG或GT型者可能是冠心病的易感人群。脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T影响冠心病发病的机制尚不清楚,可能与脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T所致脂联素基因功能变异影响了脂联素mRNA表达有关[16],也可能与脂联素基因SNPs＋45T＞G和SNPs＋276G＞T影响了血脂代谢有关[17],从而影响了冠心病的易感性,这些想法有待今后更进一步的研究证实。

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（编辑: 任开环）

Two single nucleotide polymorphisms (＋45T＞G and＋276G＞T) of adiponectin gene and coronary artery diseases in the elderly without diabetes

SHI Kailei1*, ZHU Yi1, MIAO Yingxin2, GUO Xingui1

(1Department of Cardiology,2Central Laboratory, Huadong Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

To investigate the association between two single nucleotide polymorphisms (SNPs＋45T＞G and SNPs＋276G＞T) of adiponectin gene and coronary artery diseases(CAD) in elderly patients without diabetes.Coronary angiography were performed in 688 subjects≥65 years without diabetes who were admitted to department of cardiology during November 2005 to December 2009. The subjects were divided into CAD group and control group according to coronary angiography. Genotype of two SNPs was measured by polymerase chain reaction/ligase detection reaction (PCR/LDR) assay.At＋45position, the risk rate of CAD in GG genotype was significantly increased compared with that in TT genotype(OR = 2.65,＜0.01). At＋276position, the risk rate of CAD in GG or GT genotype was significantly higher than that in TT genotype(GG: OR = 2.36,＜0.01; GT: OR =1.66,＜0.05). Logistic regression analysis showed that GG genotype at SNPs＋45T＞G, GG genotype and GT genotype at SNPs＋276G＞T were independent risk factors of CAD. Furthermore, adiponectin gene SNPs＋45T＞G and SNPs＋276G＞T displayed strong linkage disequilibrium. GG genotype was shown at SNPs＋276G＞T when SNPs＋45T＞G genotype was GG and TT genotype was shown at SNPs＋45T＞G when SNPs＋276G＞T genotype was TT, that is GGGG and TTTT genotypes. Homozygous GGGG subjects showed a significantly higher risk of CAD(OR = 4.77,＜0.01) than homozygous TTTT subjects.In non-diabetic elderly subjects, those with GG genotype at SNPs＋45T＞G, GG genotype and GT genotype at SNPs＋276G＞T are the susceptible population of CAD.

adiponectin; single nucleoside polymorphism; coronary artery disease; elderly

R541.4

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00047

2011-03-09;

2011-08-06

史凯蕾, Tel: 021-62483180-63610, E-mail: kelly953142@hotmail.com