过氧亚硝基阴离子分解催化剂对衰老大鼠血管舒张功能的保护作用

权 琳, 王 可, 杜芸辉, 王 洁, 吕婷婷, 徐海波, 刘慧荣,



过氧亚硝基阴离子分解催化剂对衰老大鼠血管舒张功能的保护作用

权 琳1, 王 可1, 杜芸辉1, 王 洁2, 吕婷婷2, 徐海波1, 刘慧荣1,2

（1首都医科大学生理学与病理生理学系, 北京 100069;2山西医科大学生理学教研室, 太原 030001）

利用过氧亚硝基阴离子（ONOO-）分解催化剂FeTMPyP探讨衰老大鼠血管舒张功能障碍的可能机制。选取雄性SD大鼠, 随机分为成年组（3～4月,= 8）、衰老组（18～20月,= 8）及给予FeTMPyP的衰老组（= 6）; 制备离体胸主动脉环, 观察血管舒张功能; 采用免疫组织化学法和Western blot法测定血管组织中可代表ONOO-生成的标记物3-硝基酪氨酸（3-NT）的表达。与成年组大鼠比较, 衰老组大鼠胸主动脉环对10-9～10-5mol/L累积浓度的内皮依赖性舒张剂乙酰胆碱（ACh）的最大舒张程度显著下降[（29.74%±8.28%）（69.52%±5.51%）,＜0.001]; 对10-9～10-5mol/L累积浓度的非内皮依赖性舒张剂硝普钠（SNP）的最大舒张程度也显著下降[（92.01%±3.19%）（99.26%±1.33%）,＜0.001]。与成年组大鼠比较, 衰老组大鼠血管组织中3-NT蛋白表达增加（＜0.05）。给予FeTMPyP后, 衰老大鼠血管组织中3-NT蛋白表达下降（＜0.01）; 抑制ONOO-的生成后, 衰老大鼠胸主动脉环对累积浓度ACh的最大舒张程度显著升高[（65.96%±11.36%）（29.74%±8.28%）,＜0.001], 对累积浓度SNP的最大舒张程度也显著升高[（98.15%±2.79%）（92.01%±3.19%）,＜0.001]。FeTMPyP改善了衰老大鼠血管舒张功能, 提示ONOO-可能在衰老大鼠血管功能障碍中起重要作用。

衰老; 血管; 血管舒张; 3-硝基酪氨酸; 大鼠

流行病学调查研究显示, 即使在无其他心血管疾病危险因素的情况下, 衰老本身即可明显增加心血管疾病发生的危险, 但其具体发病机制目前尚未明确。有文献报道, 血管内皮功能障碍已成为心血管疾病发生的重要标志之一[1,2]; 而血管内皮年龄依赖性的舒张功能障碍是人和动物血管老化的标志[3,4]。在生理情况下, 血管舒张主要是由一氧化氮（nitric oxide , NO）来发挥作用的, 然而, 在病理情况下, 体内会产生高浓度的NO, 可与超氧阴离子（superoxide anion, O2-）以弥散限制速率反应生成过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite, ONOO-）[2,5,6]。ONOO-是一种具有很强的氧化和硝基化作用的活性氮簇, 可导致体内许多重要的酶/蛋白功能受损或活性下降, 引起心血管功能障碍[7]。研究发现, 衰老大鼠血管组织中代表ONOO-生成的标记物硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine, 3-NT）含量增加, 然而这一现象并不足以证实ONOO-与衰老血管舒张功能障碍的因果关系。因此, 本实验通过在体给予衰老大鼠ONOO-的分解催化剂FeTMPyP（一种铁卟啉类化合物）, 观察血管舒张功能是否改善, 进而为证实ONOO-与衰老血管舒张功能障碍的关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

重酒石酸去甲肾上腺素注射液（上海禾丰制药有限公司）; 注射用硝普钠（sodium nitroprusside, SNP, 北京双鹤药业股份有限公司）; 乙酰胆碱（acetylcholine, ACh, Sigma公司, 美国）; FeTMPyP（C44H36FeN8·5Cl, Cayman Chemical公司, 美国）;抗3-NT单克隆抗体（StressMarq公司, 加拿大）; 小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂、浓缩型DAB试剂盒、马抗小鼠IgG/生物素标记、辣根过氧化物酶标记链亲合素（北京中杉金桥）; 抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）单克隆抗体（上海康晨生物工程有限公司）; Krebs- Henseleit液（mmol/L）: NaCl 118、KCl 4.75、KH2PO41.19、MgSO41.19、NaHCO325、Glucose 10.0、CaCl22.54, pH 7.4; 血管环张力换能器（Powerlab, Australia）;离体组织器官恒温灌流装置和BL-420F＋生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 动物分组

3～4月龄雄性SD成年组大鼠, 18～20月龄雄性SD衰老大鼠[长沙市开福区东创实验动物科技服务部, 许可证号: SCXK（湘）2009-0012]。衰老大鼠随机分为衰老组（= 8）及给予ONOO-分解催化剂FeTMPyP的衰老实验组（= 6）, 给药方式是衰老大鼠于处死前30 min静脉注射FeTMPyP（3 mg/kg）[8]。

1.3 血管功能的测定

20%乌拉坦溶液（5 ml/kg）腹腔注射麻醉动物, 剪开胸骨, 迅速取出胸主动脉, 放入预冷且氧饱和的Krebs-Henseleit（K-H）液中, 去除周围结缔组织, 将血管剪成约3～4 mm的血管环, 悬挂固定于与张力换能器相连的恒温器官浴管中, 浴管中持续通以95% O2＋5% CO2的混合气体。调节最适前负荷至2.0 g,平衡90 min, 期间每15 min更换1次K-H液。待血管环稳定后, 给予10-6mol/L的去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）收缩血管, 达峰值后, 以累积给药的方式给予10-9～10-5mol/L的ACh或SNP来观察血管的舒张功能。以10-6mol/L去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）诱发最大收缩幅度为100%, 以加入药物后的血管舒张幅度与NE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化。

1.4 血管组织中3-NT的表达

ONOO-极不稳定, 很容易降解, 因此无法直接检测其含量。组织硝基化酪氨酸形成是体内ONOO-形成的印记和标记, 其含量可以直接反应ONOO-的水平[9]。本实验中采用免疫组织化学法和Western blot法检测血管组织中3-NT表达。

1.4.1 免疫组织化学法检测血管组织中3-NT表达 将胸主动脉固定、包埋、切片、脱蜡、抗原修复后, 依次滴加3% H2O2、0.3% Triton X-100和5%胎牛血清, 随后加入一抗3-NT单克隆抗体（1:1000, 4℃过夜）、小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂, DAB显色、脱水、透明、封片。阴性对照采用 PBS代替一抗。

1.4.2 Western blot法检测血管组织中3-NT表达 称取适当量的血管组织, 加入裂解液, 置冰上剪碎、匀浆、离心10 min（4℃, 10000 r/min）, 提取上清, BCA法检测蛋白浓度。随后进行电泳、转膜、加入3-NT单克隆抗体（1:1000, 4℃过夜）、加入二抗, 最后于暗室进行发光。以GAPDH作为内参对照。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 衰老大鼠离体胸主动脉环内皮依赖性和非内皮依赖性舒张功能均明显下降

给予10-9～10-5mol/L累积浓度的内皮依赖性舒张剂ACh后, 衰老组大鼠胸主动脉环对ACh的舒张反应与成年组大鼠比较, 差异有统计学意义（＜0.001）, 而且血管最大舒张程度由（69.52%± 5.51%）降低至（29.74%±8.28%）（图1A）; 给予10-9～10-5mol/L累积浓度的非内皮依赖性舒张剂SNP后, 与成年组相比, 衰老组大鼠血管环对SNP的舒张反应也明显下降（＜0.001）, 血管最大舒张程度由（99.26%±1.33%）降低至（92.01%±3.19%）（图1B）。

2.2 衰老大鼠血管组织中3-NT的表达增加

采用免疫组织化学法检测血管组织中3-NT的表达, 与成年组大鼠相比, 衰老组血管组织中表达大量阳性3-NT棕黄色颗粒（图2A）; 同时, Western blot法测定血管组织中3-NT表达, 显示衰老血管组织中3-NT表达升高, 与成年组相比, 差异有统计学意义（＜0.05; 图2B）。

2.3 抑制ONOO-的生成后, 衰老大鼠离体胸主动脉环内皮依赖性和非内皮依赖性舒张功能均明显改善

给予ONOO-的分解催化剂FeTMPyP后, 衰老大鼠血管组织中3-NT阳性棕黄色颗粒表达减少（图2A）, 蛋白表达下降（＜0.01; 图2B）; 同时, 观察到FeTMPyP可改善衰老大鼠血管舒张功能。给予FeTMPyP后, 衰老大鼠离体胸主动脉环对10-9～10-5mol/L累积浓度的ACh的舒张反应显著改善（＜0.001）, 且血管最大舒张程度由（29.74%±8.28%）升高到（65.96%±11.36%）（图1A）; 对10-9～10-5mol/L累积浓度的SNP的舒张反应也显著改善（＜0.001）, 且血管最大舒张程度由（92.01%±3.19%）升高到（98.15%±2.79%）（图1B）。

图1　大鼠离体胸主动脉环对内皮依赖性舒张剂乙酰胆碱(A)和非内皮依赖性舒张剂硝普钠(B)的反应

Figure 1 Vasodilation responses of isolated thoracic aortic rings to acetylcholine and sodium nitroprusside

A: 对乙酰胆碱的反应; B: 对硝普钠的反应。与成年组比较,***＜0.001; 与衰老组比较,###＜0.001

图2 血管组织中3-硝基酪氨酸的表达

Figure 2 Expression of 3-nitrotyrosine (3-NT) in vascular tissues

A: 免疫组织化学（DAB, ×10）; B: Western blot 方法; C: Western blot灰度扫描图。与成年组比较,*＜0.05; 与衰老组比较,##＜0.01

3 讨 论

衰老是心血管疾病发生的主要危险因素之一,可能因为衰老过程中有血管内皮和平滑肌细胞功能障碍的发生, 或同时伴有二者之间信号转导通路的改变[10]。已有文献报道, 与成年组相比, 衰老组离体血管环（如胸主动脉、冠状动脉、肠系膜动脉等）对ACh 反应明显下降, 对SNP 反应无明显差异[3,11]。ACh 和SNP 均为血管扩张剂, 不同的是, ACh 须通过内皮细胞分泌的一氧化氮（NO）间接作用于平滑肌才能导致血管的舒张反应, 因此, 由其引起的血管舒张被称为内皮依赖性舒张, 反应血管内皮舒张功能; SNP 则不依赖内皮, 而作为NO 供体直接作用于血管平滑肌引起舒张, 这种舒张被称为非内皮依赖性舒张, 反应血管平滑肌舒张功能。本实验结果显示, 与成年组相比, 衰老组大鼠离体胸主动脉环对ACh 反应明显下降, 这与文献报道的结果一致;但衰老大鼠血管环对SNP 舒张反应也明显下降。这种血管舒张功能下降的机制不清楚, 可能是因NO生物利用度下降, 或衰老大鼠血管平滑肌表型发生改变, 即由收缩型变为分泌型[12], 或平滑肌细胞信号转导通路的改变[10,12], 或ONOO生成增加导致的毒性作用等[13]。

目前所知最强的内源性血管舒张因子是NO, 它是在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）作用下由左旋精氨酸转化而来。NOS主要包括原生型NOS（constitutive NOS, cNOS）和诱生型NOS（inducible NOS, iNOS）, cNOS又可分为神经原性NOS和内皮细胞NOS。生理情况下, cNOS即可表达, 而iNOS一般不被诱导产生。cNOS促进生成少量NO, 发挥舒血管生理作用; 病理情况下, iNOS被诱导生成, 催化合成大量NO。体内产生的高浓度NO, 与O2-以弥散限制速率（6.7×109M-1·S-1）反应生成ONOO-[5,6]。ONOO-可快速地穿过膜脂质层, 浸润细胞, 破坏许多细胞生物分子和结构, 导致细胞内受体和酶功能的钝化、DNA断裂等一系列损伤作用。然而, ONOO-极不稳定, 可与蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝化反应生成3-NT, 3-NT被公认为是组织中ONOO-生成的稳定生物学标志物[9]。我们前期研究发现[14], 在衰老大鼠血管组织中, iNOS表达增加; 给予iNOS特异性抑制剂1400w后, iNOS表达下降, 血管舒张功能部分改善。本研究中, 我们进一步观察到衰老大鼠血管组织中3-NT表达增加, 给予ONOO-分解催化剂FeTMPyP后, 3-NT表达减少, 血管舒张功能明显改善, 提示ONOO-的增加可能是衰老血管舒张功能障碍的机制之一。

FeTMPyP是一种水溶性的金属卟啉类ONOO-分解催化剂, 具有低浓度和高效率的特点, 主要通过催化ONOO-转化为硝酸盐（＞90%）, 而减轻其毒性作用, 对机体起保护作用。已有报道, FeTMPyP改善糖尿病大鼠神经病变和降低氧化硝化反应[15]、减轻顺铂诱导的肾损伤[16]及离体细胞中ONOO-的毒性反应等[17]。本研究中给予FeTMPyP后, 衰老大鼠胸主动脉环对ACh和SNP舒张反应明显改善, 证实, ONOO-参与衰老大鼠血管环内皮依赖性和非内皮依赖性舒张功能障碍。

综上所述, 衰老大鼠胸主动脉环对内皮依赖性舒张剂ACh和非内皮依赖性舒张剂SNP反应均下降, 且血管组织中3-NT表达增加; 给予ONOO-的分解催化剂FeTMPyP后, 衰老大鼠血管环对ACh和SNP舒张反应均明显改善, 提示ONOO-在衰老血管舒张功能障碍中起重要的作用, 其分解催化剂类物质可为治疗与血管功能障碍有关的心血管等疾病提供一种新的方法。

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（编辑: 王雪萍）

Peroxynitrite decomposition catalyst improves vascular dysfunction inaging rats

QUAN Lin1, WANG Ke1, DU Yunhui1, WANG Jie2, LV Tingting2, XU Haibo1, LIU Huirong1,2

(1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069;2Department of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)

To investigate the possible mechanisms of aging-associated vascular dysfunction by peroxynitrite (ONOO-) decomposition catalyst FeTMPyP.Male Sprague-Dawlew (SD) rats were randomly divided into three groups: adult group (3-4-month-old,=8), aging group (18-20-month-old,=8), and FeTMPyP treatment aging group (=6). The thoracic aorta was isolated for measurement of vascular diastolic function. Immunohistochemistry and Western-blot were performed to determine the expression of 3-nitrotyrosine (3-NT, a marker of ONOO-formation) in thoracic aortic arteries.(1) Comparing with adult group, the maximal vasodilation in aging rats induced by acetylcholine (ACh, an endothelium-dependent vasodilator, 10-9to 10-5mol/L) was significantly decreased from (69.52% ± 5.51%) to (29.74% ± 8.28%) (＜0.001); the maximal vasodilation induced by sodium nitroprusside (SNP, an endothelium-independent vasodilator, 10-9to 10-5mol/L) was also decreased from (99.26% ± 1.33%) to (92.01% ± 3.19%) (＜0.001). (2) The expression of 3-NT in aging vascular tissues was increased (＜0.05) compared with adult group. (3) In aging rats treated with FeTMPyP, the expression of 3-NT was decreased (＜0.01). Moreover, FeTMPyP significantly improved vascular endothelium- dependent and endothelium-independent vasodilations in aging rats. After inhibiting the generation of ONOO-, ACh-induced maximal vasorelaxation was markedly increased [(65.96%±11.36%)(29.74%±8.28%),＜0.001] and SNP-induced maximal vasodilation was also increased [(98.15%±2.79%)(92.01%±3.19%),＜0.001].FeTMPyP can improve vasodilation dysfunction in aging rats, suggesting that ONOO-may play an important role in aging-related vascular dysfunction.

aging; blood vessels; vasodilation; 3-nitrotyrosine; rats

(No. 30973163, 30572084)(No. PHR201106112).

R331.3＋2

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00054

2011-09-01;

2012-01-17

国家自然科学基金项目(No.30973163, 30572084); 北京市属高等学校人才强教深化计划“学校创新团队建设计划”项目(No. PHR201106112)

刘慧荣, Tel: 010-83911830, E-mail: liuhr2000@126.com