黄连温胆汤对糖尿病小鼠海马神经凋亡的影响

张卫华 ，张维新，刘华东，石富国，陈志明 ，刘 舟

（1.南京中医药大学，江苏南京210046；2.宁夏中卫市人民医院，宁夏中卫755000；3.中国药科大学，江苏南京211198）

糖尿病脑病是近几年受到研究者重视的糖尿病慢性中枢神经系统并发症，表现为痴呆样的学习和记忆功能障碍［1］。尽管糖尿病脑病的发病机制目前还没有完全明确，但研究表明，神经细胞的变性、凋亡导致中枢神经细胞的数目减少是发生认知功能障碍的重要病理基础［2］。黄连温胆汤出自清代陆廷珍《六因条辨》，由黄连、半夏、陈皮、茯苓、枳实、竹茹、炙甘草、生姜组成，具有清化痰热之功，可用于治疗痰热内扰所致的糖尿病并发症［3］，但应用于糖尿病脑病却少见报道。本研究通过黄连温胆汤干预治疗2型糖尿病小鼠后，原位末端标记法（TUNEL法）检测海马神经元的凋亡，免疫组织化学法检测caspase-3蛋白的表达，以期探讨黄连温胆汤对2型糖尿病小鼠海马神经凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.3 仪器与设备 酶标仪（Thermo，美国）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；大容量低温离心机（KUBOTA，日本）；96孔培养板（Costar，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与给药 小鼠按体重随机分为空白组（10只）和造模组，分别喂养普通饲料和高糖高脂饲料。喂养4 w后，造模组小鼠腹腔注射STZ 100 mg/kg，保证所有注射在15 min内完成。注射72 h后，禁食不禁水12 h，采用葡萄糖氧化酶法测量小鼠空腹血糖，空腹血糖值>11 mmol/L者为2型糖尿病小鼠，去除血糖值不达标小鼠，按照血糖值随机分为二甲双胍组（0.25 g/kg）、模型组、黄连温胆汤低剂量组（5 g/kg）、中剂量组（10 g/kg）和高剂量组（20 g/kg），每组 10只。造模成功后各给药组连续灌胃给药3 w，空白组和模型组给予等体积蒸馏水。

1.2.2 TUNEL法检测海马神经细胞凋亡、免疫组织化学法检测caspase-3表达 各组取5只小鼠经1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，开胸暴露心脏，经左心室插管，同时剪开右心耳，快速灌注4℃保存的生理盐水，至肝脏变白后，改灌注10%中性甲醛固定液，固定至小鼠全身僵直，切取脑组织后部分，置于4%多聚甲醛固定液24 h。进行石腊包埋后，将石蜡组织切片，按TUNEL、caspase-3试剂盒说明进行染色。各切片在400×光镜视野下随机选取3个不重叠区域，计算TUNEL、caspase-3阳性细胞数。

1.3 统计学方法

所有数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，采用单向方差分析法（ANOVA）对实验数据进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

TUNEL和caspase-3阳性细胞的表达，结果见图1、图2、表 1。

1.1.1 实验动物 清洁级ICR小鼠，4 w龄，体重18 g～22g，江苏省南京市青龙山动物养殖场提供，许可证号：SCXK（苏）2007-0001。动物分笼饲养，保持12 h昼夜节律，室温（22±1）℃，自由饮水摄食。

1.1.2 药物与试剂 二甲双胍购自上海医药（集团）有限公司信宜制药厂；链脲佐菌素（STZ）购自美国sigma公司；葡萄糖测定试剂盒购于上海荣盛生物药业有限公司；TUNEL、caspase-3检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。黄连温胆汤组成药物均购于南京先声药店丁家桥店，并经中国药科大学中药资源开发教研室秦民坚教授鉴定。药物浸泡30 min后，加8倍量的双蒸水，从煮沸起计时1 h。倒出药液后，重复加4倍水煎煮0.5 h两次。药液用8层纱布过滤2次，60℃水浴旋蒸至浓度为2g/mL（按生药量计算），4℃保存。饲料：高糖、高脂、高热量饲料的配方∶蔗糖∶猪油∶奶粉∶鸡蛋∶猪胆酸盐∶普通饲料粉=30∶20∶4∶2∶0.05∶63，由江苏省南京市青龙山动物养殖场提供。

图1 各组小鼠海马区TUNEL染色结果（400×）

图2 各组小鼠海马区caspase-3的表达（400×）

由图1～图2可见，海马神经组织TUNEL染色后阳性细胞呈棕褐色，免疫组织化学法处理caspase-3后阳性细胞呈棕黄色。由表1可以看出，与空白组比较，模型组小鼠海马TUNEL与caspase-3阳性细胞数显著增多（P<0.01）；与模型组比较，黄连温胆汤中、高剂量组及二甲双胍组小鼠海马TUNEL与caspase-3阳性细胞数显著降低（P<0.01）。

表1 黄连温胆汤对小鼠海马神经凋亡细胞和caspase-3表达的影响 （±s）

表1 黄连温胆汤对小鼠海马神经凋亡细胞和caspase-3表达的影响 （±s）

注：与空白组比较，1）P<0.01；与模型组比较，2）P<0.01

组别 n TUNEL（个） caspase-3（个）空白组 15 10.75±2.66 11.05±3.14模型组 15 38.63±10.991） 61.86±21.571）二甲双胍组 15 17.88±4.692） 21.97±8.892）黄连温胆汤低剂量组 15 32.50±8.84 43.64±15.88黄连温胆汤中剂量组 15 15.25±5.402） 24.76±7.292）黄连温胆汤高剂量组 15 14.13±5.122） 18.31±5.322）

3 讨论

糖尿病脑病是糖尿病最为常见的慢性并发症之一，主要表现为慢性进行性的认知功能障碍，尤其是学习和记忆能力的降低［4-5］。中枢神经系统中海马是与学习、记忆、认知有关的重要结构，海马区域神经细胞的变性、凋亡与其功能障碍有关［6］。本课题在研究中发现黄连温胆汤可以显著降低糖尿病小鼠空腹血糖（FBG）［7］，也可明显提高糖尿病小鼠的学习记忆认知能力［8］。

细胞凋亡的主要检测技术包括形态学方法（如光学显微镜、电子显微镜和流式细胞仪）、生物化学方法（如DNA ladder）和分子生物学方法（如 TUNEL 法）［7］。TUNEL 法是目前最常用的组织样品凋亡细胞的检测手段，但由于该法对能否区分凋亡细胞和坏死细胞尚存争议，即可能存在假阳性的缺点。因此，多数学者采用TUNEL法与相关基因表达同步测定相结合的方法进行研究。目前认为caspase是一切凋亡信号转导的共同通路，在caspase级联反应中caspase-3被认为是caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶，是细胞凋亡过程中的终末剪切酶，一旦被激活，凋亡常难以避免，该酶是否被激活也是鉴别细胞凋亡与坏死的主要依据［9］。因此，本研究在使用TUNEL法检测脑组织凋亡细胞的基础上，同步进行caspase-3基因表达的免疫组织化学检测，一方面克服单纯TUNEL法可能出现假阳性的缺点，另一方面能更深入研究细胞凋亡的作用机理。研究结果显示，黄连温胆汤能显著抑制海马神经凋亡，减少caspase-3蛋白的表达，说明黄连温胆汤参与了依赖于casepase-3蛋白的神经细胞凋亡的保护。

总之，黄连温胆汤能显著改善2型糖尿病小鼠的认知功能，其机制可能是通过减少caspase-3蛋白的表达，从而抑制海马神经凋亡。由于糖尿病脑病发病机制复杂，中药复方多成分多靶点的特点，黄连温胆汤治疗糖尿病脑病的具体机制有待进一步深入研究。

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［2］张红.糖尿病脑病研究进展［J］.临床荟萃，2003，18（8）：478-47.

［3］王永山.温胆汤治疗糖尿病并发症刍议［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11（4）：158-160.

［4］Biessels G J，vander Heide L P，Kamnal A，et al.Ageing and diabetes：implications for brain function［J］.Eur J Pharmacology，2002，441（l/2）：1-14.

［5］Trudean F，Gagnon S，Massicotte G.Hippocampal synaptic plasticity and glutamate receptor regulation：influences of diabetes mellitus［J］.Eur J Pharmacology，2004，490（l/3）：177-186.

［6］Savitz S I，Rosenbaum D M.Apoptosis in neurological disease［J］.Neurosurgery，1998，42（3）：555-574.

［7］张卫华，刘华东，刘舟，等.黄连温胆汤对2型糖尿病小鼠血糖的影响［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13（8）：118-119.

［8］张卫华，刘舟，石富国，等.黄连温胆汤对2型糖尿病小鼠学习记忆及海马神经细胞形态的影响［J］.时珍国医国药，2012，23（4）：948-949.

［9］傅桂莲.分子生物学检验技术［M］.北京：人民卫生出版社，2003：201-213.