高压氧对小鼠胫骨骨折愈合过程中骨生物力学特性及胶原蛋白含量的影响

谭 嘉，谭海涛，陈国平，李 晓，邓贵全，黄晓荣，甘 智，梁旭权

基础研究

高压氧对小鼠胫骨骨折愈合过程中骨生物力学特性及胶原蛋白含量的影响

谭 嘉，谭海涛，陈国平，李 晓，邓贵全，黄晓荣，甘 智，梁旭权

目的探讨高压氧对小鼠胫骨骨折愈合过程中骨生物力学特性及胶原蛋白含量的影响。方法采用简单随机抽样法将216只昆明小鼠随机分为对照组（108只）和高压氧组（108只），建立胫骨骨折模型。高压氧组予以高压氧治疗，对照组不予高压氧治疗。分别于骨折后1、2、3、4周取材，取材前通过行为学评分和斜板实验评价两组小鼠的行为学特征，观察取材后胫骨的一般生物学特征，检测胫骨标本的抗扭力和抗折力，测定胫骨骨痂组织的胶原蛋白含量，同时采用改良Masson染色对骨痂组织中的胶原蛋白进行组织学观察。结果与对照组相比，高压氧组小鼠骨折后1、2周行为学评分降低；2、3、4周斜板实验坡度升高（P＜0.05）。骨折后1周高压氧组小鼠右侧胫骨宽度（骨痂处）、胫骨抗折力均大于对照组，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；骨折后2周高压氧组小鼠右侧胫骨抗扭力高于对照组，骨折后1、2、3周右侧与左侧胫骨抗扭力比值以及两侧胫骨抗折力比值均高于对照组，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；高压氧组小鼠骨折后1、2、3、4周骨痂胶原纤维含量高于对照组（P＜0.05），且高压氧组改良Masson染色出现较多的蓝色反应。结论在小鼠胫骨骨折的愈合过程中，高压氧治疗提高了骨痂组织中胶原蛋白的含量，增强了骨的生物力学性能，对骨折愈合起到促进作用。

高压氧；胫骨骨折；骨折愈合；生物力学；胶原蛋白；小鼠

随着现代工业的快速发展以及交通事故的增多，创伤性骨折的发生率呈逐年升高的趋势。体外研究结果显示，高压氧状态有助于软骨样组织向骨组织的转化，同时对成骨细胞的增殖和分化有促进作用[1-2]；而骨胶原蛋白的合成、分泌与骨修复的质量直接相关[3-5]。临床研究亦证实，高压氧具有促进骨折愈合的作用[6-9]。本研究通过制作小鼠胫骨骨折的动物模型，观察高压氧治疗后骨折愈合处骨生物力学特性及胶原蛋白含量的改变，探讨高压氧在骨折愈合中的作用机制，为临床上高压氧疗法在创伤骨科的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6周龄SPF级昆明小鼠（广西医科大学动物实验中心，实验动物合格证号：SCXK桂2009-0002）216只，雌雄不拘，采用简单随机抽样法随机分为高压氧组（108只）和对照组（108只）。

1.2 主要试剂、仪器和设备

羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），改良Masson三色染色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司产品）。

动物高压氧舱（青岛平度高压氧舱设备厂），紫外-可见分光光度计、分析天平（上海精科仪器公司），恒温水箱（北京博医康实验仪器有限公司），恒温干燥箱（南通泰宇实验仪器有限公司产品），Olympus显微镜（Olympus公司，日本），扭力计（台湾路昌仪器公司），折力实验装置（自制），量角器、游标卡尺（市售）。

1.3 胫骨骨折模型的制作

高压氧组和对照组均在小鼠右侧胫骨（模型侧）制作骨折模型，左侧胫骨（对照侧）不作处理。以10%（100 mg/kg）水合氯醛腹腔麻醉成功后，左手捉拿小鼠的背部，右手触摸到小鼠右侧胫骨后，在中段以食指固定，向外侧折断胫骨，听到“嗒”的一声视为骨折成功，然后立刻予以复位，复位后未采用任何形式的内固定或外固定。

1.4 实验动物的处理

行骨折处理后，高压氧组于每天下午16时至17时予以高压氧治疗（用99.2%氧气冲洗舱3次后，在20 min内使舱内压力升至0.2 MPa，氧气浓度维持在95%～97%，并保持该压力60 min，减压20 min后出舱），1次/d；对照组不予高压氧治疗。两组动物常规饲养，自由活动。分别于骨折后1、2、3、4周取材。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学特征 各时相点每组随机选取16只小鼠称量体质量，置于实验台上自由走动。按如下标准进行痛行为学评分[10]：0分：行动正常，模型侧和对照侧后肢动作相同；1分：模型侧后肢有跛行，但行走不需抬高患肢；2分：模型侧后肢跛行明显，有停步抬高患肢现象；3分：不能使用模型侧患肢。斜板实验[11]：将小鼠放在1块100 cm×50 cm的光滑玻璃板上（距玻璃板底60 cm），以玻璃板平面和水平线为夹角，缓慢匀速抬起玻璃板的另一端，量角器记录小鼠在玻璃板上滑下时的夹角度数，重复3次。测试完毕后放回笼中备用。

1.5.2 胫骨一般生物学特征 各时相点每组随机选取16只小鼠行颈椎脱臼处死后，迅速剥离左、右两侧胫骨，剔除筋膜及软组织并称取湿重，用游标卡尺测量胫骨的长度和宽度，然后将骨标本置入EP管内标记备用。

1.5.3 胫骨抗扭力 每组随机选取8份测量后的骨标本，用扭力计测定左、右侧胫骨抗扭力，并计算右侧与左侧胫骨抗扭力的比值。实验后全部骨组织回收至EP管内，放入60℃烤箱24 h后记录胫骨干重。

1.5.4 胫骨抗折力 用抗折力装置分别测定两组剩余8份测量后骨标本左、右侧胫骨的抗折力。参照文献[10]自行制作抗折力装置：用铁架台固定一特制钢条，钢条前端有一约长2 cm、宽1 cm的孔。将骨标本横向固定在钢条的孔隙中间，用粗线将水瓶悬挂在骨折处，测试时缓慢加水至标本折断，每次用天平称量水瓶及水的总重量，该重量即为胫骨的抗折力。同时计算右侧与左侧胫骨抗折力的比值。实验后全部骨组织回收至EP管内，置入60℃烤箱24 h后记录胫骨干重。

1.5.5 胫骨骨痂处胶原蛋白

1.5.5.1 含量 各时相点每组随机选取8只小鼠，颈椎脱臼处死后迅速取其右侧胫骨骨痂组织50～80 mg，置于6 mmol/L的氢氯酸中，95℃水浴消化5 h，取出消化液，按照试剂盒说明书测定样品中羟脯氨酸的含量，并计算骨痂组织中胶原蛋白的含量（羟脯氨酸含量/13.4%）。

1.5.5.2 组织学观察 各时相点每组随机选取3只小鼠，行颈椎脱臼处死解剖后在小鼠骨折处取骨痂上下0.5 cm左右组织，经多聚甲醛固定、脱蜡后包埋、石蜡切片后，采用改良Masson三色染色法[12]观察骨痂处胶原蛋白的改变。

1.6 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（χ-±s）表示，采用独立样本的t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量变化情况

骨折后1、2、3、4周高压氧组小鼠体质量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表1），提示高压氧对小鼠的体质量无明显影响。

2.2 痛行为学评分结果

骨折后两组小鼠右侧肢体均出现严重跛行，视为3分。随着骨折的愈合，痛行为学评分逐渐降低。如表2所示，高压氧组小鼠骨折后1、2周痛行为学评分低于对照组（P＜0.05），3、4周两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 对照组与高压氧组小鼠骨折后各时相点体质量的比较结果（χ-±s，n=16，g）

表2 对照组与高压氧组小鼠骨折后各时相点痛行为学评分的比较结果（χ-±s，n=16，分）

表3 对照组与高压氧组小鼠骨折后各时相点斜板实验坡度的比较结果（χ-±s，n=16，°）

2.3 斜板实验坡度

如表3所示，随着时间的推移，两组斜板实验坡度逐渐增高。与对照组比较，高压氧组小鼠骨折后2、3、4周斜板实验坡度高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 胫骨长度和宽度

如表4所示，骨折后1周高压氧组小鼠右侧胫骨宽度（骨痂处）大于对照组（P＜0.05），其余指标两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；骨折后2、3、4周高压氧组双侧胫骨宽度、长度与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 胫骨湿重和干重

如表5所示，各时相点高压氧组小鼠右侧胫骨湿重、干重以及干重/湿重比值与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.6 胫骨抗扭力

如表6所示，各时相点两组小鼠左侧胫骨的抗扭力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；骨折后1、3、4周两组右侧胫骨抗扭力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；但骨折后2周时高压氧组小鼠右侧胫骨抗扭力高于对照组（P＜0.05）。此外，高压氧组小鼠骨折后1、2、3周右侧与左侧胫骨抗扭力比值高于对照组（P＜0.05），但骨折后4周两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.7 胫骨抗折力

如表7所示，各时相点两组小鼠左侧胫骨抗折力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；骨折后1周高压氧组小鼠右侧胫骨抗折力高于对照组（P＜0.05），骨折后2、3、4周高压氧组小鼠右侧胫骨抗折力与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05 ）。此外，骨折后1、2、3周高压氧组小鼠右侧胫骨与左侧胫骨抗折力比值高于对照组（P＜

0.05 ），骨折后4周两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.8 胫骨骨痂胶原蛋白含量

如表8所示，高压氧组各时相点胫骨骨痂胶原蛋白含量均高于对照组，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。改良Masson染色组织学结果显示，随着时间的推移，两组改良Masson染色中蓝色反应逐渐增多，而高压氧组小鼠骨折后3、4周的组织蓝染明显强于对照组（图1，2）。

3 讨论

高压氧治疗目前已成为临床治疗学的一个重要组成部分，应用日趋广泛。近几年来，诸多文献报道了高压氧对骨折愈合的影响，研究结果证实，高压氧能够增加动脉血氧的部分压力，扩大弥散量和弥散距离，提高血到组织的氧溶解能力，促进侧支循环的形成，有助于骨折后成骨细胞的生长和新生毛细血管的形成，进而加速骨折愈合和骨生成[13-15]。

表4 对照组与高压氧组骨折后各时相点小鼠胫骨长度和宽度的比较结果（χ-±s，n=16，mm）

有研究结果显示，对植入人重组骨形成蛋白的大鼠给予高压氧治疗，其新骨形成明显高于不予高压氧治疗的对照组[16]。本研究结果亦显示，骨折后1周高压氧组小鼠右侧胫骨宽度（骨痂处宽度）显著增加，说明高压氧可能通过加速骨折愈合初期骨痂的形成，以达到对骨折愈合的正向促进作用；研究结果还显示，高压氧组小鼠骨折后1、2周痛行为学评分低于对照组，骨折后2、3、4周斜板实验坡度升高，表明高压氧治疗在减轻骨折疼痛的同时，可能还具有改善胫骨骨折肢体功能恢复的功效，这些结果都是证实高压氧促进小鼠胫骨骨折愈合的有力证据。

骨胶原蛋白是人体骨骼、关节软骨、骺软骨和骨小梁的主要组分，主要分布于骨松质。有研究结果显示，骨胶原蛋白含量的增加可导致骨小梁变厚，韧性增加[17]。而羟脯氨酸是骨胶原蛋白中特有的氨基酸，因此测量骨痂组织羟脯氨酸的含量，可以间接反映骨组织中胶原蛋白含量的变化。本研究结果显示，高压氧组小鼠骨折后1、2、3周右侧与左侧胫骨抗扭力的比值及抗折力的比值

均高于对照组，同时，高压氧组小鼠骨痂组织的胶原蛋白含量在各时相点均高于对照组，提示高压氧治疗能够提升骨组织的抗折弯能力和韧性，促进骨生物力学性能的恢复；而其抗折弯能力和韧性的增强可能与骨骼中胶原蛋白含量的增加有相关关系。

表5 对照组与高压氧组骨折后各时相点小鼠右侧胫骨湿重和干重的比较结果（χ-±s，n=16）

表6 对照组与高压氧组骨折后各时相点小鼠胫骨抗扭力的比较结果（χ-±s，n=8）

表7 对照组与高压氧组骨折后各时相点小鼠抗折力的比较结果（χ-±s，n=8）

表8 对照组与高压氧组骨折后各时相点小鼠胫骨骨痂胶原蛋白含量的比较结果（χ-±s，n=8，μg/mg）

改良Masson染色可用来评价骨质的成熟程度，特别是在骨折愈合过程中，可作为评价骨痂成熟程度的重要指标，即蓝色着染的比例越多，胶原蛋白含量越高，骨痂越成熟[18]。我们观察发现，随着时间的推移，两组改良Masson染色中蓝色反应均逐渐增多，说明骨折愈合过程中胶原蛋白含量呈升高趋势，骨痂也在逐渐生长；但与对照组比较，高压氧组小鼠骨折后3、4周的组织染色明显增多，证实高压氧治疗进一步提高了骨痂组织中胶原蛋白的含量，加速了骨痂组织的成熟。

需要强调的是，成熟骨中约90%的有机质是胶原，占骨干重的30%左右；而90%以上的无机质是矿物质钙、磷沉积形成的羟基磷灰石[17]。载体骨胶原的增多导致骨盐沉积增加，使骨重增加，因此胫骨干重与骨胶原、钙、磷含量的综合测定可以反映骨量的变化以及骨的矿化程度。尽管本研究中两组小鼠在骨湿重、干重及干湿重比值方面差异无统计学意义，但高压氧治疗对骨钙、磷等其他矿物含量及代谢情况的影响仍值得进一步关注。

综上所述，高压氧治疗可以促进骨折愈合过程中早期骨痂的形成，加速骨生物力学性能的恢复，其机制可能是通过增加骨痂组织中胶原蛋白含量来促进骨痂组织成熟，进而有助于骨折愈合。

图1 对照组骨痂胶原蛋白改良Masson染色组织学结果（×40）1A骨折后1周 1B骨折后2周 1C骨折后3周 1D骨折后4周 图2高压氧组骨痂胶原蛋白改良Masson染色组织学结果（×40）2A骨折后1周 2B骨折后2周 2C骨折后3周 2D骨折后4周

[1]Wu D,Malda J,Crawford R,et al.Effects of hyperbaric oxygen on proliferation and differentiation of osteoblasts from human alveolar bone[J].Connect Tissue Res,2007,48 (4):206-213.

[2]Bassett CAL,Herrmann I.Influence of oxygen concentration and mechanical factors on differentiation of connective tissue in vitro[J].Nature,1961(190):460.

[3]袁绍辉,刘伟,吴滨奇,等.骨质疏松性骨折愈合过程中Ⅰ,Ⅱ型胶原蛋白表达与其力学性能[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(2):208-212.

[4]Shen B,Mu JX,Pei FX.Relationship among bone mineral density,collagen composition,and biomechanical properties of callus in the healing of osteoporotic fracture[J].Chin J Traumatol,2007,10(6):360-365.

[5]Liu SH,Yang RS,al-Shaikh R,et al.Collagen in tendon, ligament,and bone healing:a current review[J].Clin Orthop Relat Res,1995(318):265-278.

[6]van Merkesteyn JP,Balm AJ,Bakker DJ,et al.Hyperbaric oxygen treatment of osteoradionecrosis of the mandible with repeated pathologic fracture:report of a case[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol,1994,77(5):461-464.

[7]武展雄,郭志坚,任龙韬.空心加压螺钉联合高压氧治疗股骨颈骨折21例治疗体会[J].山西医药杂志,2011,40(3): 287-288.

[8]周笑珍,邓珍良.高压氧和音乐治疗对骨折愈合效果的观察[J].护理实践与研究,2009,6(12):12-13.

[9]龚海涛,宫峰,严力生,等.胫骨中下段粉碎性骨折术后高压氧治疗的疗效观察[J].海军医学杂志,2011,32(6):386-388.

[10]杨和金,郑永仁,苏梅,等.络通接骨药酒的镇痛作用及对动物骨折愈合的影响[J].云南中医学院学报,2009,32(4): 21-24.

[11]李晓青,孙玉明,黄章翔,等.Walker256乳腺癌细胞构建大鼠胫骨骨癌痛模型[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2008,15(1): 41-45.

[12]Liu YH,Hsia TC,Liu JC,et al.Fracture of the maxillary bone during hyperbaric oxygen therapy[J].CMAJ,2008,179 (12):1351.

[13]Bennett MH,Stanford R,Turner R.Hyperbaric oxygen therapy for promoting fracture healing and treating fracture non-union[J].Cochrane Database Syst Rev,2005,25(1): CD004712.

[14]Butler J,Foex B.Best evidence topic report:hyperbaric oxygen therapy in acute fracture management[J].Emerg Med J,2006,23(7):571-572.

[15]张立国,宋映女,曹连生,等.高压氧对骨折愈合的临床观察[J].中华航海医学杂志,1997,4(2):116-117.

[16]李善昌,李伟,张婷,等.高压氧对人重组骨形成蛋白诱导骨形成的影响[J].黑龙江医药科学,2003,26(3):26-28.

[17]陈祥和,李世昌.运动与骨胶原蛋白[J].山西师大体育学院学报,2011,26(3):109-114.

[18]胥维勇,杨红,李科,等.改良Masson胶原纤维染色法在半薄切片中的应用[J].中国组织化学与细胞化学杂志,1996,5 (3):248-249.

Effect of hyperbaric oxygen on the biomechanic characteristics and the content of collagen of the bone during tibial fracture healing in mice

TAN Jia,TAN Haitao,CHEN Guoping,LI Xiao,DENG Guiquan,HUANG Xiaorong,GAN Zhi,LIANG Xuquan.Orthopaedic Department,Guigang People's Hospital,Guangxi 537100,China.

TAN Haitao,E-mail：tanhaitao99@hotmail.com

Objective To explore the effect of hyperbaric oxygen（HBO）on the biomechanic characteristics and the content of collagen of the bone during tibial fracture healing in mice.Methods Models of tibial fracture were made in 216 mice which were randomly divided into control group(n=108)and HBO group(n=108)by simple random sampling.HBO group was treated by HBO while control group was not given HBO.Animal behavioral features were observed in two groups according to the behavioral scores and the oblique plate assay. Then samples were prepared at 1,2,3 and 4 weeks after the fracture,general biological features of tibia were recorded,torsional forces and anti-fracture forces of the bone samples were examined,the content and the histological results of collagen in tibial bony callus tissue were evaluated.Results Compared with the control group,the behavioral scores in HBO group were lower at 1 and 2 weeks after the fracture,while the angle value through oblique plate assay showed continuously higher at 2,3 and 4 weeks after the fracture(P＜0.05).For HBO group,the width of osteotylus and anti-fracture forces of the right tibia were greater than those of control group at 1 week after the fracture,the difference between two groups had statistical significance(P＜0.05); torsional forces of the right tibia was stronger than that of control group at 2 week after the fracture,the ratio of torsional forces,and the ratio of anti-fracture forces between right and left tibia were higher than those of control group at 1,2 and 3 weeks after the fracture(P＜0.05),the difference had statistical significance(P＜0.05).The content of collagenous fiber in osteotylus showed higher in HBO group than that in control group at 1,2,3 and 4 weeks after the fracture(P＜0.05),furthermore,more and more blue color reaction responded to the modified Masson staining could be seen continuously in HBO group.Conclusion HBO can increase the content of collagen in bony callus tissue and enhance the biomechanic features of bone which will improve the bone healing.

Hyperbaric oxygenation;Tibial fractures;Frature healing;Biomechanics;Collagen;Mice

R459.6，R683.423

A

1674-666X(2012)01-0048-09

2011-12-20；

2012-01-24）

（本文编辑 白朝晖）

10.3969/j.issn.1674-666X.2012.01.008

537100广西省贵港市人民医院骨科

谭海涛，E-mail：tanhaitao99@hotmail.com