真菌多糖定量检测方法研究进展

赵 艳 毕荣宇 牟德华

（河北科技大学，河北 石家庄 050018）

真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中提取出来的，由10个以上单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物［1］。具有抗感染、抗辐射、降血糖、治疗肿瘤等多种生物活性，被称 为“生 物 应 答 效 应 物”（biological response modifier，BRM）［2］。目前，真菌多糖已成为食品科学、分子生物学、医药学等领域研究的热点之一，而多糖的定量分析检测是这些研究的基础。随着分析检测技术的发展，多糖的检测技术呈现多元化，正朝着便捷、精确的方向发展。多糖定量检测方法包括比色法、色谱法、分子光谱法等［3－5］。

传统测定多糖含量的方法是比色法，该方法的基础是使多糖降解后与特定物质发生显色反应，在最大吸收波长下测定吸光值，进行定量测定。这种方法操作简便，易于实现。常用的比色法是苯酚－硫酸法，该方法稳定性良好、重现性高，是一种精确的测定多糖含量的方法。色谱法测定多糖含量包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）等［3］，这些方法主要用于组成多糖的单糖定量、定性分析，其应用使得多糖的结构分析、性能研究有了进一步发展。

应用以上方法需要对多糖进行复杂的处理，如：多糖的降解、单糖的衍生化；同时对色谱柱、检测器等要求较高，如果只是简单的定量分析，可以选用快速、操作简单的方法，如：刚果红检测法［6］、共振光散射法［7］。刚果红是一种染料，其可与β－葡聚糖发生特异性结合，使待测溶液的最大吸收峰发生红移，然后再根据吸光值和不同浓度多糖溶液的线性关系进行定量分析。多糖属于大分子物质，有机染料在多糖表面发生堆积时可导致体系共振光散射信号的增强，通过增强的信号可对多糖进行含量测定。

1 比色法

比色法是一种传统的测定多糖含量的方法，其基本原理是［8］：用硫酸或盐酸处理多糖，使多糖在强酸中脱水生成糠醛或其衍生物，然后利用紫外－可见分光光度计测定反应溶液的吸光值，结合标准曲线，进行多糖的定量测定。常用的比色法有苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法、地衣酚－硫酸法等。

其中苯酚－硫酸法是应用最为广泛的一种方法，苯酚硫酸法的具体原理为［9］多糖和寡糖被浓硫酸水合产生的高温水解成单糖，单糖在强酸条件下又与体系中的苯酚发生显色反应，生成橙色衍生物，该衍生物在波长490nm 处具有最大吸收峰。在一定范围内，吸收值与糖浓度呈现线性关系，因此可以进行定量测定。精密度试验、稳定性试验、重现性试验等都表明苯酚－硫酸法是一种使用性广、精确度高、稳定性好、重现性好的测定真菌多糖的方法［10－12］。

孙国琴等［12］对苯酚－硫酸法测定杏鲍菇多糖进行了研究，并对该方法的测定波长、显色温度、显色时间、苯酚用量进行了优化，优化之后加样回收率达到99.16%，RSD 为1.16%。显色液在120min内稳定，说明这种方法精确度高、稳定性好。

何新益等［13］采用改良的苯酚－硫酸法测定了苦瓜提取物中的多糖含量，该方法以混合单糖代替葡萄糖作为对照，制作标准曲线，消除了单一以葡萄糖为对照造成的系统误差。结果表明，糖浓度在20～100μg范围内该方法线性关系良好；该法的平均回收率达100.68%，其供试液在2h内显色稳定。

多数情况下采用苯酚－硫酸法时，一般都用紫外－可见分光光度计，当样品数目较多时，操作就很繁琐，同时由于仪器不稳定带来的误差就无法避免。近年来，有学者开始使用酶标仪进行相关物质的测定［14－17］，该仪器可以同时处理十几甚至几十个样品，具有快速、便捷、精确度高等优点。杨定清等［14］使用多功能酶标仪代替紫外－可见分光光度计对香菇总糖含量进行了测定，研究表明该方法可以实现对样品的快速测定，所需试样量小，是一种理想的测定香菇中总糖含量的方法。

2 色谱法

2.1 气相色谱法

气相色谱法测定糖类始于1958年，该方法具有选择性强、分辨力好、灵敏度高以及分析速度快等优点，近年来，因毛细管色谱柱和程序升温技术的普遍使用，糖类的气相色谱测定方法得到更广泛的应用［8］。另外，气相色谱与质谱联用可以得到有关单糖残基类型、键连接方式、糖的序列、糖环的形式、聚合度等多种结构信息［18］。

糖类物质本身没有足够的挥发性，在进行气相检测时，必须先对其进行衍生化，使其转化为易挥发、对热稳定的衍生物，再进行检测。目前常用的衍生物有三甲基硅烷化衍生物、三氟醋酸酯衍生物、糖醇醋酸酯衍生物、糖肟和糖腈衍生物［8，19，20］。在某些衍生物制备过程中，会生成衍生物的异构体，在进行气相检测时会生成干扰峰，因此在进行衍生化时，应根据具体的物质，选择合适的衍生物制备方法，使每种单糖分离出单一的色谱峰。

高庚申等［19］采用预衍生化－毛细管柱气相色谱法对单糖进行了测定，并对5种毛细管柱和3种衍生化方法进行了综合比较，选出了2种分离效果较好的毛细管柱，同时发现糖腈乙酰化反应操作简便，避免了由于生成异构体和歧化反应出现的多峰现象，这种衍生化方法更适合单糖的气相色谱定量分析。应用该方法测定了7种单糖，其分析响应信号与浓度均保持一定的线性关系。

李小定等［21］将提取纯化的4 种灰树花多糖级分用2mol／L的三氟乙酸在110 ℃下水解2h，然后将降解成的单糖制成乙酰酯生物，再选用毛细管色谱柱进行单糖的分离，测出了4种多糖级分的单糖组成，回收率试验结果显示平均回收率在98.5%～101.6%，表明该方法有较高的回收率，方法稳定性良好。

朱彩平等［22］对提取的枸杞多糖进行了水解、单糖糖腈乙酰化处理，然后进行气相色谱分析，结果表明，枸杞多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6种单糖组成，其 含 量 分 别 为5.59%，45.57%，4.07%，1.85%，7.83%，35.07%。

2.2 液相色谱法

2.2.1 可见光检测法 糖类物质不具有紫外吸收，较早期选用液相法检测糖类物质时，需配备特定的检测器，最常用的是示差检测器，这种方法无需对糖类物质进行衍生化，相对来说比较简单［20］。谢明勇等［23］选择示差折光检测器，以蒸馏水为流动相，用高效液相色谱法对茶叶多糖的含量进行了测定。研究过程中他们以自制的茶叶多糖纯品作为标准品，绘制了标准曲线，以此为基础对多种茶叶中多糖的含量进行了测定，结果表明该方法简单、准确、可靠，适合于作为茶叶多糖原材料和产品质量控制的方法。韩振泰等［24］选用专用的糖分析柱，以分子量为104的葡聚糖为标品，使用示差折光检测器，对灵芝多糖的含量进行了测定，方法回收率为98%～104%，相对标准偏差为0.12%，表明该方法是一种准确性好、精密度高的测定灵芝多糖的方法。

除了示差检测器外，还有学者选用普通的紫外－可见分光光度计进行多糖含量的测定。木海鸥等［25］将提取自人参渣的多糖进行水解，然后选择紫外－可见分光光度计对其含量进行了液相检测。在进行定量检测时，选择D－无水葡萄糖作为对照品，先对该单糖在紫外区的最大吸收波长和出峰时间进行了确定，然后对人参多糖水解后的单糖进行了测定。试验结果表明，葡萄糖质量浓度在0.5～10.0 mg／mL 范围内与峰面积线性关系良好，精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验也说明该法可靠、灵敏度高，可用于人参渣中多糖含量的测定。

2.2.2 紫外衍生法 虽然选用示差折光检测器对多糖进行液相检测操作比较简单，但示差检测器灵敏度低、易受流速、压力和组分改变的影响［8，19］。近年来出现了一种新的方法——衍生法，其原理是利用衍生化试剂处理多糖，使其变成具有对紫外或荧光敏感的衍生物，进而使用常用的紫外－可见分光光度计或者荧光检测器进行检测。该法又分为柱前衍生和柱后衍生两种，常用的是柱前衍生法，即：分离前预先将样品转化为衍生物，然后进行分离、检测。常用的糖类紫外衍生化试剂有：2，4－二硝基苯、对甲氧基苯胺、2－氨基吡啶、6－氨基喹啉、苯甲酸、对氨基苯甲酸乙酯、吡唑啉酮，其中最常用的是吡唑啉酮试剂；常用的荧光检测衍生试剂有［20］：3－（4－羧基苯甲酰基）－2喹啉羧基醛（CBQCA）、2－氨基吖啶（2－AA）、8－氨基萘－1，3，6－三磺酸（ANTS），1－氨基芘－3，6，8－三磺酸（APTS）等。

目前多糖测定常用的方法是：选用1－苯基－3甲基－5吡唑啉酮（PMP）作为衍生试剂，对多糖进行柱前衍生，然后进行液相紫外检测，研究表明这种方法可以快速、有效地分离单糖组分，这种方法精确度高、稳定性良好、重现性好［26－30］。杨兴斌等［26］采用PMP 对10 种标准单糖进行衍生化，在40min内实现了10种单糖的分离，重复性试验结果表明，其可重复性范围为94.6%～108.0%，相对偏差低于4.9%，该方法适用于绞股蓝茶多糖的分离鉴定，同时，研究过程中用三乙胺作为流动相改良剂，分离效果明显提高。戴军等［27］采用柱前衍生高效液相色谱法对杜氏盐藻多糖的单糖组成进行了测定，他们对衍生化条件和水解条件进行了优化，同时对液相条件（乙腈的百分含量，磷酸盐的pH 值）进行了优化，结果表明这种柱前衍生法对于单糖的检测有较高的准确度，杜氏岩藻多糖主要是由葡萄糖和半乳糖组成的。

2.3 高效薄层色谱法

传统的薄层色谱法是将样品点到平板上，用展开剂进行展开，然后用显色剂进行显色，将显色后的斑点与已知标品进行比较定性分析，将斑点洗脱下来后进行扫描等处理可进行定量分析。现在，所说的薄层色谱法是指高效薄层色谱法，随着薄层色谱扫描仪的出现，薄层色谱法变得越来越快捷、方便。

Eliza Malinowska等［31］采用薄层色谱法对猴头菇多糖进行了测定，研究过程中使用一次性微型定量吸管吸取3μL的样品在硅胶板上进行点样，然后用苔黑酚－硫酸进行原位乙酰化，显色之后用双波长进行扫描检测，与传统的显色方法相比，这种方法的线性范围更为广泛，也更加灵敏和迅速。

邓国栋等［32］采用双波长薄层色谱扫描法测定了茶多糖的单糖组成，使用硫酸将茶多糖进行水解，水解后的单糖再进行层析，然后利用薄层扫描仪进行扫描，将水解的单糖与几种标准品比对进行定性，采用外标法进行量的测定，该方法对阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖的线性范围为1 200～7 200μg；4种单糖的回收率分别为97.6%，98.5%，98.1%，95.9%，说明这种方法具有良好的准确性。

万仁玲等［33］建立了一种控制黄芪多糖粗粉质量的方法，用苯酚－硫酸法测定黄芪多糖粉中总糖的含量，用薄层色谱半定量法测定黄芪多糖粗粉中低聚糖的含量，专属性验证表明，应用此法对葡萄糖和蔗糖进行鉴别时，不会受多糖类和皂苷类物质的干扰，同时，稳定性、重复性、加样回收率结果也表明该方法有良好的准确性，可作为检测黄芪多糖粗粉质量的有效方法。

以上几种方法都属于多糖定量测定的间接方法，都是在多糖降解为单糖之后进行测定的。下面介绍几种利用多糖和相关物质发生反应，然后进行定量测定的直接检测方法。

3 刚果红检测法

刚果红检测法特别适用于具有β－三股螺旋结构的葡聚糖的定量测定。刚果红是一种染料，β－葡聚糖与刚果红发生特异性结合时会导致刚果红的最大吸收峰发生红移，即向长波长方向移动，且多糖浓度在一定范围内时，刚果红荧光吸收值的增加与多糖浓度的增加成线性关系，据此可以对β－葡聚糖进行定量测定［6，34］。Helga Moleken等［6］使用此方法测定了β－葡聚糖的含量，研究过程中对刚果红的浓度进行了优化，结果表明当刚果红的浓度为0.08%时，这种方法有较高的灵敏度。杜先锋等［35］采用刚果红法测定了燕麦中β－葡聚糖的含量，同时研究了pH 值、时间、温度、杂质等因素对测定结果的影响，确定了最佳反应pH 值、时间和温度，并且添加的一些杂质如可溶性淀粉、酪蛋白等对测定结果均无影响，说明刚果红与β－葡聚糖有较高的专一性结合。

4 共振光散射法

共振光散射技术的原理是［36］：有机染料在蛋白质、核酸等生物大分子上进行堆积导致强烈的共振光散射增强，信号的增强与生物大分子浓度具有线性关系，据此可进行物质的定量分析，这种技术使用普通的荧光分光光度计即可，具有便于操作的优势［30］。多糖分子属于天然的大分子物质，也可以采用共振光散射法这一新颖的测定技术。王元凤等［7］利用共振光散射法对茶多糖的含量进行了测定，研究表明向氯化十六烷基吡啶－氢氧化钠（CPC－NaOH）体系中添加茶多糖TPS时，体系的共振光信号明显增强。TPS的浓度为2.0～20.0μg／mL时，共振光信号的增强与多糖的浓度呈线性关系，这种方法便于操作，且具有较高的选择性和稳定性，具有明显的优势。

从以上介绍的几种方法可以看出，对于真菌多糖的定量测定，这些方法各有各的特点。传统的比色法操作简便，可实现多糖含量的快速测定。气相色谱、高效液相色谱法，需要对样品进行复杂的衍生处理，操作相对繁琐，但这些方法可实现多糖的单糖组成测定、结构分析等复杂研究。刚果红检测法和共振光散射法则是利用多糖属于大分子这一特性，实现对其定量检测。同时，这些方法具有一定的针对性，如：刚果红染料专一地与具有三股螺旋结构的多糖分子发生结合，可实现具有该结构的多糖分子的检测。

多糖作为一种大分子物质，其生物活性与其含量、分子结构、单糖组成等有密切关系［37］。这些结构与活性关系的研究，即构效关系研究，都是以文章提到的这些方法为基础的，随着技术的发展，多糖的定量测定方法日趋多元化，为研究人员提供了更多的选择余地，同时先进仪器设备的推出，使得操作越来越简便，结果越来越精确，为多糖的进一步研究奠定了良好的基础。

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