过敏原分离纯化技术的研究进展

孙秀兰，单晓红，张银志，管 露，尹德成

（1.江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

过敏原分离纯化技术的研究进展

孙秀兰1，2，单晓红2，张银志1，管 露2，尹德成2

（1.江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

过敏原是引起过敏反应的抗原性物质，对它的检测是预防发生过敏反应的重要方法，而过敏原分离纯化是过敏原检测技术的基础。主要叙述了过敏原的致敏机理，同时详细叙述了沉淀法、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、膜分离、蛋白质组学和人工合成过敏原技术在过敏原分离纯化中的研究进展，重点介绍蛋白质组学和人工合成过敏原技术这两种分离纯化的新方法。

过敏原，纯化，表征

过敏反应在日常生活中很常见，是在全世界广泛流行的由过敏原引起的一类变态反应性疾病。引起人体过敏反应的物质有很多，但大体主要分为两类，一是环境，环境中能刺激机体发生过敏反应的物质都可以叫过敏原，比如室内灰尘、花粉类、真菌类、兽毛和纤维等[1]；二是食物，食物中也有许多能引起人的过敏症状。已有160多种食物被确认具有过敏原性。FAO报告的8类过敏食物为主要的食物过敏原来源，约占所有食物过敏原的90%，广泛分布于农作物、畜禽产品和水产品中，它们是牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类（虾、蟹、龙虾）、花生、大豆、核果类（杏子、腰果等）及小麦[2]。由于食物分布的广泛性，再加上现在人们物质生活的丰富，发生过敏反应的机会也越来越多，而过敏反应能引起急性或慢性疾病，已经严重影响了部分人群的生活质量和生命安全，因此对食物过敏原的检测是十分必要的，而高纯度且具有免疫活性的过敏原是检测技术的物质基础，因此过敏原分离纯化是过敏原研究发展中至关重要的一环。

1 过敏原致敏机理

过敏原是指能选择性地激活T细胞和B细胞，诱导产生特异性IgE抗体，引起变态反应的抗原性物质。一般来说，动物性食物过敏反应很少见，大多只发生在鸡蛋和牛奶中，而植物性食物种类就很多。这主要是因为植物受到外来的刺激损伤或袭击时，它们就会产生一系列应激反应并合成蛋白质来保护自己[3]。一般称合成的蛋白为防御蛋白或致敏蛋白。致敏蛋白具有对T细胞和B细胞的识别区，能够产生特异性的抗体，因此过敏原就含有T细胞抗原决定簇和B细胞抗原决定簇。抗原决定簇是过敏原中参与抗体结合的组成部分，是引发食物过敏反应的免疫学物质基础，它一般是小于16个氨基酸残基的短肽，现在了解得比较清楚的是牛奶中的过敏原。Véronique Schulten等采用了32个重叠肽分析T细胞识别表位，从而确定了αs1-酪蛋白肽链17～36位，69～78位，109～120位和173～194位可被IgE识别，其中69～78位和173～194位只被终身过敏的人群所识别[4]。Gloria García-Casado等研究发现аs2-酪蛋白有4个抗人血清B细胞识别的主要表位（IgE表位），分别为肽链83～100位，143～158位，157～172位，165～188位；其中83～100位和165～188位为最主要过敏原，143～158位含有一个磷酸化的位点，这可以增加其过敏性；αs2-酪蛋白的6个次要IgE表位分别为：肽链31～44位，43～56位，93～106位，105～114位，117～128位，191～200位[5]。抗原性的大小一般与分子量有关，当分子量在一万以上的时候，就会产生免疫刺激，从而引发特异性IgE抗体，随后与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面结合，如果机体第一次接触该抗原，机体会成为致敏状态。当再次接触该抗原后，就会发生过敏反应。该反应的机理是：抗原与肥大细胞或嗜碱粒细胞表面上的IgE抗体结合，在钙离子的作用下，肥大细胞破溃和嗜碱粒细胞脱颗粒，释放许多生物活性物质，如白三烯、组胺等，这些物质的释放就会出现一些常见的过敏症状，如粘膜水肿、平滑肌痉挛、分泌亢进等，还有一些物质叫做半抗原，由于分子量太小，不能直接成为抗原，但与其他物质复合后就可以成为抗原。

2 过敏原分离纯化技术

2.1 分离纯化天然过敏原

2.1.1 盐析沉淀法 水溶液中的蛋白质溶解度一般在生理离子强度范围内最大，而低于或高于此范围时溶解度均降低。一般认为，向蛋白质的水溶液中逐渐加入电解质时，开始阶段蛋白质的溶解度增大，这种现象称为盐溶，随着电解质强度的增大，蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。在食品过敏原的分离纯化过程中，常用硫酸铵来粗分这些过敏蛋白。

使用比较多的是大豆、牛乳、鸡蛋等食品中的过敏原提取[6-8]，目前，这种方法一般不会单独使用，而是作为一个预处理的步骤来粗提纯过敏原，之后还要与其他方法结合进一步提纯，如离子交换、亲和层析、凝胶过滤等。

2.1.2 等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法。这种方法适用于疏水性较大的蛋白质，如酪蛋白。因此，这种方法在牛乳过敏原的分离纯化中使用得较多，其他的食物提取中一般不使用这种方法，而且，这种方法也很少单独使用，经常是与盐析法结合在一起使用。

蒋红玲等[9]采用等电点沉淀法分离出脱脂乳中酪蛋白，（NH4）2SO4两步法盐析乳清，去除大量杂蛋白后，经纯化，得到酪蛋白、β-Lg和α-La这三种牛奶中的过敏原组分，并且取得了较好的分离纯化效果，纯度都大于90%。这种方法经济便捷、重复性好，是牛奶中蛋白提取比较常见的粗提方法。

2.1.3 疏水性相互作用色谱（HIC） HIC是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类大分子分离纯化的洗脱色谱法。HIC是基于疏水性吸附分离纯化蛋白质类生物大分子，与离子交换色谱互补短长，可以分离纯化离子交换层析难以分离的蛋白质，而且它可以调节疏水配基链长和密度调节吸附力，可以根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂，因此在过敏原的分离纯化过程中，可以使蛋白质的损失减到最小。该技术已成功被用于过敏原的分离纯化。

Roland Suck等人[10]直接使用疏水作用层析将猫尾草主要过敏原Phlp1和Phlp 2/3分离纯化出。P.Cadot等人[11]则是通过疏水作用层析和离子交换联合使用，纯化了18ku的花粉过敏原Bet v 7，得到的纯度为94%。

2.1.4 离子交换色谱（IEC） 离子交换色谱利用离子交换剂为固定相，是根据荷电溶质和离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。它是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要分离纯化手段，它的应用范围广泛，处理料液量大，分离过程具有浓缩作用，而且产品回收率高。

杨睿等[12]利用层析对大黄鱼过敏原进行纯化，使得大黄鱼粗提液蛋白中过敏原的含量从50%左右上升到90%，并且均具有免疫活性。吴序栎等人[13]通过离子交换层析初步分离出了21、11ku的过敏原蛋白，而且含量较高且具有免疫活性。张英坤等人[38]使用离子交换层析法分离花生过敏原Ara h 2时，纯度达到了90%，得率为21.9%，该方法为过敏原的分离研究提供了可行的实验参数。Janine E.Beale等人[40]在纯化鱼小白蛋白时，先使用硫酸铵进行粗提，再利用阴离子交换柱进行纯化，得到纯度较高的三种小白蛋白过敏原。Satoshi Koyanagi等人[41]在研究规模化生产尘螨过敏原C8/119S时，使用两次离子交换和一次疏水层析色谱进行纯化得到的重组过敏原，纯度达到99%，从而可以高效地生产过敏原。

2.1.5 凝胶过滤色谱（GFC） GFC是利用凝胶粒子（通常称为凝胶过滤介质）为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。溶质由于分子大小的不同而被分离，在洗脱的过程中，相对分子质量大的溶质由于不能进入凝胶孔，所以最先被洗脱下来，而相对分子质量小的溶质进入凝胶孔，流速缓慢，洗脱下来的时间较长，因此出峰时间较后。它通常是用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。与其他色谱法相比，GFC的最大特点是操作简便，可采取恒定洗脱法洗脱展开，而且速度快、精度高、蛋白活性收率高。但由于该技术仅基于溶质之间的相对分子量的差别，选择性低，一般需和其他操作联合进行，如超滤、离子交换和亲和色谱等。

Hiroyuki Tanaka等人[14]用DE52纤维素和琼脂糖凝胶以及高效液相色谱纯化分离大麻花粉过敏原，从而分离并且纯化出大麻花粉的五种过敏原。M.Luisa Tejera等人[15]在对橄榄树的一种新的过敏原Olee 7进行分离纯化时，将凝胶过滤层析和反相高效液相色谱联合使用，将原先未发现的过敏原分离纯化出来，并且得到的纯度较高，为分子表征的分析提供了基础。

2.1.6 亲和层析 生物分子能够区分结构和性质非常详尽的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合，利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和分离。亲和层析具有高度的选择性，在过敏原纯化的应用中是比较常见的。

Fariba Karamloo等人[16]在研究桦树花粉过敏原时，对从大肠杆菌中提取出来的过敏蛋白进行纯化时，使用了Ni螯合亲和层析，纯化后的纯度达到了90%。Lai-Chen Tsai等人[17]在分离纯化一种新型的98ku的尘螨过敏原时，使用亲和层析，使得蛋白的纯化回收率高达80%，并且纯化后的过敏蛋白具有生化和免疫特点。

2.1.7 膜分离 膜分离法包含非常丰富的内容，但在生物分离领域应用得比较多的是超滤、透析等，其中超滤在过敏原的分离过程中起着非常重要的作用。超滤是根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别进行分离的方法，它是利用膜的筛分性质，以压差为传质推动力，将原料液中溶剂及小溶质粒子从高压的料液侧被膜透过到低压侧，而相对分子质量相对较高的蛋白组分被膜所截留，其他小的溶质颗粒和水则能透过膜，从而达到选择性分离的目的。透析是利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜将含有高分子溶质和其他小分子溶质的溶液与纯水或缓冲液分隔，由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质透过膜向另一侧，而另一侧的水则透向高分子溶液中。这两种方法和设备都很简单，价格低廉，在过敏原的分离过程中，超滤使用得最多，而且通常与其他技术联用。

Barbara Pantera等人[18]从黄蜂毒液中纯化得到主要过敏原Polistes gallicus时，使用了超滤和亲和层析柱，纯化出四种过敏原，并且纯度很高，为他们对这些过敏原的表征奠定了基础。Plaimein Amnuaycheewa等人对大豆制品中的过敏原（Gly m 3）进行纯化表征时，将透析、超滤和亲和层析联合使用，从而得到的过敏原的纯度在豆奶中为（4.37±0.14）～（7.24±0.30）mg/g蛋白质之间，而其他发酵豆制品中Gly m 3的含量为（1.67±0.02）～（5.47±0.02）mg/g蛋白质之间，纯化的效率很高。

2.1.8 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics）是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。李林[37]在2000年就对蛋白质组学的研究前景以及发展方向做了预测，他认为质谱法和同位素标记法的联合使用可以定量分析蛋白质表达水平的差异，双向电泳技术和质谱技术是蛋白质组学的关键技术。从现在的研究成果看，他的分析大部分都是正确的。在现代的蛋白质组学研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合是科学家掌握蛋白质表达规律的基础。二维电泳主要是用来分离蛋白质，可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量的差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000～3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶；也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。胶染色后可以利用凝胶图像分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过特定的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据，这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。因此蛋白质组学的研究通常是通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。A.I. Sancho等人[20]对于蛋白质组学在过敏原分离上的应用进行了阐述，并且提出了蛋白质组学在过敏原分离上的可行性，以及对过敏原分析进行标准化这一概念，这对我们分离蛋白质以及之后的应用有很大的启示，为蛋白质组学在过敏原分离纯化上的应用奠定了基础。

2.2 人工合成过敏原

人工合成过敏原的一般方法是通过查阅文献结合生物信息学方法选取得到某种物质过敏原的主要抗原表位区，构建该区段及其二聚体的原核表达载体，得到具有免疫学活性的高表达抗原表位蛋白。具体过程是：首先选取过敏原蛋白中的一段，作为目标基因，这段基因具有确切的抗原表位。选定目标基因之后，就可以为这段目标基因设计引物，进行PCR扩增，从而可以得到抗原表位区基因和二聚体基因，然后构建重组质粒，转化到宿主细胞，诱导使之产生过敏蛋白，这种过敏蛋白是以包涵体的形式出现的，随后就可以收集蛋白并纯化鉴定过敏原的免疫原性。Elena Tambobrini等人[21]就是通过这种方法，在大肠杆菌中得到合成的重组过敏原Lol pⅡ，并用凝胶电泳和聚丙烯酰胺电泳对其进行了纯化和鉴定。这种重组过敏原的产量非常高，而且很容易纯化，它和天然的过敏原对IgE的结合能力相当，并且免疫原性和天然蛋白相当，是一种很稳定的过敏原蛋白。Katrin Lehmann等人[22]同样也是在大肠杆菌中得到了花生主要过敏原Ara h 2，这种过敏原也是高度表达并且免疫原性也同天然蛋白相当。Yukihiro Kobayashi等人[23-26]发现了异尖线虫的主要过敏原Ani s 1，他们也是通过重组过敏原在大肠杆菌中表达的方法，来得到纯的并且产量多的过敏蛋白，从而可以研究这种蛋白的功能，作为一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂。Budhi Pandjaitan等人[27]在研究重组狗白蛋白时，就是完全按照上述方法，重组载体转化到大肠杆菌中，然后得到包涵体、蛋白等，再进行纯化，得到高纯度和高产量的重组过敏原蛋白。其他很多学者都使用这种方法来得到纯的并且具有免疫活性的过敏蛋白。Motohik Suzuki等人[28]对日本柏树主要过敏原Cha o 1进行分子克隆，对其进行纯化，从而得到该过敏原。M.Serdal Sevinc等人[29]对青霉的主要过敏原Pen b 26使用这种方法进行了表达和纯化，同样得到了高收率以及具有免疫活性的过敏原蛋白。李辉严等人[39]在大肠杆菌中高效表达了重组粉尘螨过敏原并获得了大量的纯化蛋白，并且从实验中发现这种重组过敏原具有低过敏原性，可应用于易于标准化的安全高效的脱敏治疗剂。

人工合成过敏原的基础就是必须清楚过敏原的表征。过敏原的表位即抗原表位，又称抗原决定簇，是肽类抗原与抗体或受体接触的部位，是抗原分子表面几个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构，是抗原特异性的基础，它由两种要素组成，其一是氨基酸的顺序，其二是氨基酸的空间构象。根据过敏原表位与细胞结合方式，可分为B细胞表位和T细胞表位；根据表位结构的不同，又可分为连续性过敏原表位（线性表位）和不连续性过敏原表位（构象性表位）。线性表位主要是识别过敏原中的特定的氨基酸序列，一般比较多见，而且易于定位；而构象性表位则不同，它是一些不连续的氨基酸通过分子内及分子间相互作用等使之相互接近，形成表位，这种构象性表位一般不稳定，随着三级结构的破坏，其表位也会破坏，同时可能会产生新的表位。Thien Van Do等人[30]研究了阿拉斯加青鳕和普通鳕鱼过敏原的表征，发现阿拉斯加青鳕过敏原的过敏性比普通鳕鱼的过敏性高18%，而其他免疫原性都几乎差不多。Claudia de Lalla等人[31]研究黑麦花粉过敏原Lo1 p II时，发现在过敏原抗原表位区的第39～51位氨基酸是与抗体直接结合的部位。Angel Vallverdu等人[32]在研究重组青蒿主要过敏原时，发现重组的过敏原具有与天然的过敏原相同的免疫活性，这是因为这种重组的过敏原具有β折叠。Tsunehiro Aki等人[33]比较了重组和天然尘螨的免疫学表征，发现这两者的免疫原性很接近，重组过敏原与IgE的反应识别率达到了80.6%，而天然的过敏原（Der f 1和Der f 2）与IgE的识别率分别是90.3%和74.2%。Yago Pico de Coana等人[34]在研究柏木的新的过敏原Cup a 4时，发现这种新的过敏原含有四种过敏表位区域，与柏木其他的过敏原有相似性。Liselotte Kaiser等人[35]研究猫主要过敏原Fel d 1的结构表征，发现这种过敏原有两个表征位点，一个是外部钙离子结合位点，另一个是蛋白质内部钙离子结合位点。

当然重组过敏原并不是都能成功的，Erica van Oort等人[36]发现重组过敏原group1很难正确的折叠，所以效果都不好，因此需用天然的过敏原来代替。他们找到的天然过敏原与重组过敏原的同源性达到了98%，因此很适合作为替代。

3 展望

过敏原的分离纯化是研究其过敏原性的基础，是对其进行开发利用的重要环节，目前关于过敏原的分离纯化技术有很多，但是使用时还需注意以下几点：一是考虑使用时的生产成本和经济效益，选择合适的方法是很重要的；二是同时使用几种纯化方法，使过敏原的纯化效率提高；三是可以进行新技术的开发，使过敏原得到高效的纯化。

新技术的使用对于过敏原的分离纯化来说是一个突破口，如蛋白质组学和过敏原的表征这些方面，在过敏原方面的运用才刚刚起步，但是优势已经显现出来，如运用过敏原的表征，可以创造出重组过敏原，从而可以得到高产量和高纯度的过敏原蛋白。但同时也需要注意，重组过敏原的免疫原性是否有变化，若是和天然的过敏原免疫原性差别较大，那么就有可能失去重组过敏原的意义，因此今后的工作就是怎样得到准确折叠的重组过敏原。目前研究的主要是花生和鸡蛋中的过敏原，由于运用一般的分离纯化技术得到的过敏原纯度不是很高，今后的工作重点在于纯熟地运用蛋白质组学和重组过敏原这些新兴的技术，从而获得纯度较高的过敏原，为过敏原的检测奠定基础。

[1]刘静，陈庆森.食品过敏原研究进展及其在食品安全重要性方面的探讨[J].食品科技，2006（4）：1-3.

[2]郑义成，华萍，杨安树，等.食物中过敏原检测技术研究进展[J].食品科学，2010，31（21）：417-420.

[3]Valenta R，Kraft D.From allergen structure to new forms of allergen-specific immunotherapy[J].Allergy and Hypersensitivity，2010，13：718-727.

[4]Schulten VR，Astrid R，Christina H，et al.Characterization of the allergic T-cell response to Pru p 3，the nonspecific lipid transfer protein in peach[J].J Allergy Clin Immunol，2009，124（1）：100-107.

[5]Casado GG，Luis FP，Perales AD，et al.Identification of IgE-binding epitopes of the major peach allergen Pru p 3[J].J Allergy Clin Immunol，2003，112（3）：599-605.

[6]Hildebrand S，Steinhart H，Paschke A.Comparison of different extraction solutions for the analysis of allergens in hen’s egg[J]. Food Chemistry，2008，108：1088-1093.

[7]Marc JC，Herve B，Gilles C，et al.Expression，purification and immunochemical characterization of recombinant bovine betalactoglobulin，a major cow milk allergen[J].Molecular Immunology，1996，33（14）：1113-1118.

[8]Lin J，Fido R，Shewry P，et al.The expression and processing of two recombinant 2S albumins from soybean（Glycine max）in the yeast Pichia pastoris[J].Biochimica et Biophysica Acta，2004，1698：203-212.

[9]蒋红玲，向军俭，王宏，等.牛奶中过敏原组分的分离纯化及主要过敏原的鉴定[J].暨南大学学报，2008，29（4）：341-346.

[10]Suck R，Hagen S，Cromwell O，et al.Rapid and efficient purification of Phleum pratense major allergens Phl p 1 and group Phl p 2 or 3 using a two-step procedure[J].Journal of Immunological Methods，1999，229：73-80.

[11]Cadot P，Diaz JE，Proost P，et al.Purification and characterization of an 18-kd allergen bf birch（Betula vewucosa）pollen：Identification as a cyclophilin[J].J Allergy Clin Immunol， 2000，105（2）：286-291.

[12]杨睿，吴海强，刘志刚.大黄鱼过敏原的提取、分离及免疫学特性鉴定[J].卫生研究，2009，38（1）：60-62.

[13]吴序栎，陈永娟，刘志刚.腰果主要过敏原分离鉴定与纯化[J].中国公共卫生，2009，25（3）：298-299.

[14]Tanaka H，Degawa M，Kawata E，et al.Identification of Cannabis pollens using an allergic patient’s immunoglobulin E and purification and characterization of allergens in Cannabis pollens[J].Forensic Science International，1998，97：139-153.

[15]Tejera ML，Villalba M，Batanero E，et al.Identification，isolation，and characterization of Ole e 7，a new allergen of olive tree pollen[J].J Allergy Clin Immunol，1999，104（4）：797-802.

[16]Karamloo F，Schmitz N，Scheurer S，et al.Molecular cloning and characterization of a birch pollen minor allergen，Bet v 5，belonging to a family of isoflavone reductase-related proteins[J]. J Allergy Clin Immunol，1999，104（5）：991-999.

[17]TsaiLC，ChaoPL，ShenHD，etal.Isolation and characterization of a novel 98-kd Dermatophagoides farinae mite allergen[J].J Allergy Clin Immunol，1999，102（2）：295-303.

[18]Barbara P，Donald R，H Lara C，et al.Characterization of the major allergens purified from the venom of the paper wasp Polistes gallicus[J].Biochimica et Biophysica Acta，2003，1623：72-81.

[19]Plaimein AC，Elvira GM.Purification，characterisation，and quantification of the soy allergen profilin（Gly m 3）in soy products [J].Food Chemistry，2010，119：1671-1680.

[20]Sancho AI，Mills ENC.Proteomic approaches for qualitative and quantitative characterisation of food allergens[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2010，58：42-46.

[21]Tamborini E，Brandazza A，LallaB，et al.Recombinant allergen Lol pⅡ：Expression，purification and characterization[J].Molecular Immunology，1995，32（7）：505-513.

[22]Katrin L，Hoffmann S，Neudecker P，et al.High-yield expression in Escherichia coli，purification，and characterization of properly folded major peanut allergen Ara h 2[J].Protein Expression and Purification，2003，31：250-259.

[23]Yukihiro K，Shoichiro I，Yuji N，et al.Anis the major allergen of Anisakis simplex：Purification by affinity chromatography and functionalexpression in Escherichia coli[J].Parasitology International，2008，57：314-319.

[24]Yukihiro K，Kuniyoshi S，Shoichiro I，et al.Purification and cDNA cloning of a new heat-stable allergen from Anisakis simplex[J].Molecularamp;Biochemical Parasitology，2007，155：138-145.

[25]Kuniyoshi S，Hironori M，Kaori I，et al.Purification and molecular cloning of a major allergen from Anisakis simplex[J]. Molecular and Biochemical Parasitology，2004，135：69-75.

[26]Rodriguez MA，Miguel GM，Aguado FG，et al.Cloning and characterisation of the Anisakis simplex allergen Ani s 4 as a cysteine-protease inhibitor[J]. International Journal for Parasitology，2007，37：907-917.

[27]Budhi P，Swoboda L，Pichler FB，et al.Escherichia coil expression and purification of recombinant dog albumin，a crossreactive animal allergen[J].J Allergy Clin Immunol，2000，105（2）：279-285.

[28]Motohiko S，Naoki K，Makoto I，et al.Purification，characterization and molecular cloning of Chao 1，a major allergen of chanecyparis obtusa（Japanese Cypress）pollen[J]. Molecular Immunology，1996，33（4）：451-460.

[29]Sevinc MS，Kumar V，Makonnen A，et al.Expression and characterization of Pen b 26 allergen of Penicillium brevicompactum in Escherichia coli[J].Protein Expression and Purification，2009，65：8-14.

[30]Thien VD，Hordvik I，Endresen C，et al.Characterization of parvalbumin，the major allergen in Alaska pollack，and comparison with codfish Allergen M[J].Molecular Immunology，2005，42：345-353.

[31]Claudia DL，Tamborini E，Longhi R，et al.Human recombinant antibody fragments specific for a rye-grass pollen allergen：characterization and potential applications[J]. Molecular Immunology，1996，33（13）：1049-1058.

[32]Angel V，Asturias JA，Arilla MC，et al.Characterization of recombinant Mercurialis annua major allergen Mer a 1（profilin）[J].J Allergy Clin Immunol，1998，101（3）：363-370.

[33]Tsunehiro A，Takeshi K，Akihiro F，et al.Immunochemical characterization of recombinant and native tropomyosins as a new allergen from the house dust mite，Dermatophagoides farinae [J].J Allergy Clin Immunol，1995，96（1）：74-83.

[34]Yago PC，Nuria P，Fuertes MA，et al.Molecular cloning and characterizationofCupa4，anew allergen from Cupressus arizonica [J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，401：451-457.

[35]Kaiser L，Tanja CV，Martinez DB，et al.Structural characterization of the tetrameric form of the major cat allergen Fel d 1[J].J Mol Biol，2007，370：714-727.

[36]Oort EV，Heer PG，Dieker M，et al.Characterization of natural Dac g 1 variants：An alternative to recombinant group 1 allergens [J].Allergy Clin Immunol，2004，114（5）：1124-1130.

[37]李林.蛋白质组学的进展[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（3）：227-231.

[38]张英坤，陈红兵.离子交换层析法分离花生过敏原Ara h2的研究[J].食品科学，2006，27（12）：259-262.

[39]李辉严，马三梅，邹泽红，等.重组低过敏原性粉尘螨过敏原的表达及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志，2010，26（5）：447-449.

[40]Beale JE，Jeebhay MF，Lopata AL.Characterisation of purified parvalbumin from five fish species and nucleotide sequencing of this major allergen from Pacific pilchard，Sardinops sagax[J]. Molecular Immunology，2009，46：2985-2993.

[41]Satoshi K，Toshio M，Toshihiro M，et al.Production-scale purification of the recombinant major house dust mite allergen Der f 2 mutant C8/119S[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，110（5）：597-601.

Research progress in allergen purification

SUN Xiu-lan1，2，SHAN Xiao-hong2，ZHANG Yin-zhi1，GUAN Lu2，YIN De-cheng2
（1.The State Key Lab of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Allergens antigenic substances that cause allergic reactions，its detection is an important method to prevent allergic reactions，and purification of allergens is the basis for allergen detection.This paper describes the mechanism of allergen sensitization，while detailed description of the precipitation，hydrophobic interaction chromatography，ion exchange chromatography，affinity chromatography，gel filtration chromatography，membrane separation，proteomics and synthetic allergen in purification of allergens in the research progress，focusing on synthetic technology of this new method of allergen.

allergen；purification；characterization

TS201.1

A

1002-0306（2012）05-0391-05

2011-04-20

孙秀兰（1976-），女，博士，教授，主要从事食品安全检测方面研究。

“十二五”国家科技支撑计划（2011BAK10B03）；973“国家重点基础研究发展计划资助”项目（2012CB720804）；2010年度公益性行业（农业）科研专项项目（201003008-08）。