MicroRNA在炎症性肠病中的研究现状及应用于针灸调控机制研究的思考

丰晓溟,马晓芃,吴焕淦,赵琛,刘慧荣

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.上海中医药大学针灸推拿学院,上海 201203)

克罗恩病(Crohn disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是炎症性肠病的两种主要类型,临床表现相似,因长期腹痛、腹泻、便血而影响患者身心健康。近年来,中国人 IBD发病率有上升趋势。西医治疗以控制炎症反应和缓解肠外症状为主,但本病发病机制尚不清楚,使得西医学治疗手段受限。中医药尤其是针灸对于IBD的治疗有独特优势[1-3],但其调节机制尚有待于进一步揭示。MicroRNA(miRNA)是新近发现的具有调控 mRNA表达功能作用的小分子RNA,其对免疫系统细胞的发育分化[4-6]、炎性因子的产生[7]有重要调节作用,miRNA在炎症性肠病发生发展中的作用已成为近年来研究的热点。本文综述miRNA在炎症性肠病中的研究现状,并探讨从 miRNA角度研究针灸治疗炎症性肠病作用机制的意义和重要性。

1 miRNA的生物合成及生物学功能

miRNA首先在细胞核内由内含子转录为pri-microRNA转录子[8,9],后者经双链的RNA核酸内切酶Drosha与DGR8整合,成为长约70个碱基对的茎环,即前体 microRNA(Pre-microRNA)[10]。Pre-microRNA通过输出蛋白5转运至胞浆,经Dicer核酸内切酶折叠为小的双链RNA双螺旋分子,成熟的miRNA整合到RNA诱导沉默复合物(RNA-inducing silencing complex,RISC)里。成熟的miRNA是一类非编码单链小分子RNA,长度约22～24个核苷酸,通过识别特定的靶mRNA 的 3’ 非 编 码 区(3’-untranslated region,3’-UTR)并与之互补配对,从而降解 mRNA或阻遏其翻译,实现抑制蛋白编码基因的表达。miRNA的表达模式具有高度保守性、时序性和组织特异性,在不同组织、不同发育阶段中表达水平有显著差异,是调控其他功能基因表达的重要分子。目前已知的人类基因组约有1500个miRNAs(http://www.mirbase.org/),对多达1/3的基因发挥着下调作用,一个miRNA能调控上百个蛋白编码的 mRNA[11],而一个 mRNA又可受多个miRNA调控[12,13]。miRNAs可不被RNA酶降解,因而能在血浆和体液中有稳定表达[14]。大量的研究表明,miRNA可调节多种细胞过程,包括细胞周期、细胞分化增殖、凋亡、免疫功能等,从而参与发育调控、器官形成、肿瘤生成、免疫应答等生物学过程[15]。miRNAs参与免疫细胞的产生和分化、天然免疫和获得性免疫应答反应,且与免疫系统疾病密切相关。对miRNAs的深入研究对生物进化探索、基因功能研究、人类疾病防治具有重要意义。

近年来IBD在中国发病率逐年上升,中国人UC发病率约为 11.6/105,CD发病率和患病率分别为0.848/105和2.29/105[16]。虽然CD和UC可通过病史、体格检查、影像学、血清标志物、内镜和组织化学等方法鉴别,但仍有 10%的结肠炎症无法明确诊断。UC和CD病因尚未完全阐明,可能与患者遗传易感性、肠黏膜微环境和肠道异常免疫应答有关,有明显的遗传危险因素模式和基因及蛋白表达特征[17-22]。基于miRNA在肿瘤发生,自身免疫调节中可能发挥的关键调节作用,提示miRNA可能成为IBD基因水平发病和治疗的新靶点。与癌症研究类似的是,目前miRNA在炎症性肠病中的研究主要围绕miRNA特异表达谱及诊断学指标的筛选。

2 miRNA在IBD中的研究现状

炎症性肠病受到复杂的基因网络调控。由于mRNA数量庞大,研究其与炎症性肠病的关系十分困难,难以系统地阐释其复杂的相互关系。而目前发现的 miRNA数量相对较少,但功能庞大,研究miRNA对炎症性肠病炎症过程靶基因复杂网络的调控更易阐释。迄今为止,IBD中miRNA表达谱的研究主要包括IBD患者与健康人的差异表达谱,以及CD和UC患者的差异表达谱研究。尽管CD和UC患者临床表现相似,但许多研究显示两者的发病机制并不相同,其差异不仅包含免疫反应的相关基因,还涉及纤维化、代谢、生物合成、细胞增殖和电解质转运等多个过程的基因表达差异[19-25]。IBD研究的热点主要集中在导致CD和UC发病差异的基因调控机制,而基因转录后调控引起的疾病表型差异也已引起关注,miRNA负向调控mRNA稳定性和蛋白翻译过程就是一个重要的转录后调控机制。

2.1 IBD结肠中miRNA特异性表达谱研究

2008年的一项研究发现,与健康人比较,活动期UC患者结肠的 11个 miRNA有表达差异,其中 3个miRNA(miR-192,miR-375和 miR-422b)表达显著降低,8个 miRNA(miR-16,miR-21,miR-23a,miR-24,miR- 29a,miR-126,miR-195和let-7f)表达显著升高。而与健康人比较,非活动期 UC患者结肠 3个miRNA(miR-21,miR-375和 miR-422b)表达增高,4个miRNA(miR-23a,miR-16,miR-24和 miR-29a)表达降低[26]。其中miR-21是IL-6介导的STAT3依赖性miRNA家族,miR-192与促炎因子MIP-2a的表达呈负相关。这些差异至少提示两点,一是 miRNA的异常调节可能通过促进活性促炎因子的释放,而在UC发病中起关键作用;二是不同的 miRNA的表达差异可能参与结肠免疫平衡的调节和炎症的维持。

另一临床研究显示[27],与健康人比较,活动期 CD患者乙状结肠中 miRNA表达上调的有 miR-23b、miR-106和 miR-191,表达下调的有 miR-19b和miR- 629;而慢性活动期末段回肠 CD患者结果显示,和健康人比较,miR-16、miR-21、miR-223和miR-594在末段回肠活检样本中表达上调。其中,miR-21在牛皮癣[28]和系统性红斑狼疮[29]报道有显著上调;miR-223在克罗恩病及类风湿病人T细胞中[30]均有显著上调。

以上结果显示与健康人比较时,CD和 UC的差异miRNA表达谱较少重叠,提示miRNA参与UC和CD发病机制也是不同的。深入研究其机制,尚需揭示 miRNA与其靶基因的相互作用以明确miRNA的更多功能。

2.2 IBD外周血miRNA表达谱研究

IBD外周血miRNA特异性表达谱研究可能对IBD诊断学意义重大,可应用于诊断学指标的筛选。尽管肠镜活检能够最直观地反应结肠组织病变状况,但是取肠组织活检使其成为一种侵入性诊断方法。相比之下,循环血miRNA更易获取,也易于被患者接受,更具有临床诊断价值。研究显示[31],活动期 CD患者外周血miR-362-3p表达最显著,活动期 UC患者 miR-505、miR-103-2、miR-362-3p表达差异最显著。且 11种miRNA可区分活动期UC和CD患者。但该结果与肠组织结果并不完全吻合,提示外周血与肠组织存在miRNA组织特异性表达,两种组织的miRNA差异及功能尚需进一步研究。

另一项新研究发现希腊CD患者外周血中miR-16、miR-23a、miR-29a、miR-106a、miR-107、miR-126、miR-191、miR-199a-5p、miR-200c、miR-362-3p、miR-532-3p表达与健康人有显著差异;UC患者外周血miR-16、miR-21、miR-28-5p、miR-151-5p、miR-155和miR-199a-5p与健康人表达有显著性差异,其中UC患者的miR-155表达最高[32]。

IBD外周血miRNA表达的研究刚刚开展,以上研究提示不同人群的外周血筛选的 miRNA指标可能不同,若能在此基础上进一步大样本筛选出CD和UC患者外周血特异性表达的 miRNA,则可能会成为鉴别诊断 CD和UC的有效指标,从而提高临床的诊断率。而不同种族的miRNA特异性表达谱在IBD患者中尚不多见,仍有待于临床研究的进一步深入。

3 应用miRNA研究针灸调节IBD机制的思考

针灸对炎症性肠病确有疗效已得到临床证实[33,34],机制方面的研究也提示针灸的调节作用是多水平、多靶点的。多项研究均显示针灸能够从基因水平调节炎症性肠病,应用基因表达谱芯片技术研究UC大鼠结肠组织的基因表达谱,得到在UC大鼠结肠中异常表达、隔药灸治疗后得到调节的差异表达基因 174条,分析表明艾灸治疗对基因表达的影响涉及细胞骨架运动相关基因、免疫相关基因(如 IL-1b、IGF-1等)、基础代谢相关基因、炎症相关基因等;对UC针灸调节分子免疫学机制的研究发现,隔药灸与电针能够降低溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜中 IL-1b、IL-6、IGF-l mRNA表达及iNOS mRNA表达,上调IL-1ra mRNA 表达,有效地控制UC已启动的炎症和免疫级联反应,促进溃疡的愈合[35];临床研究也显示,艾灸可能是通过下调 UC患者结肠黏膜IL-8 mRNA的表达,抑制ICAM-1mRNA表达,从而达到治疗之目的[33,34]。对克罗恩病针灸调节分子免疫学机制的研究显示,针灸能显著降低模型大鼠结肠黏膜异常增高的TNF-a、IL-12、IFN-g、IGF-l mRNA表达;提升结肠黏膜异常降低的IL-4、IL-10 mRNA表达[36-38]。这些研究均提示针灸对 IBD的多个炎症相关基因具有调节作用。

在此基础上,应用数量较少、但功能庞大的miRNA研究针灸对炎症性肠病炎症过程靶基因复杂网络的调控,将有助于全面深入地剖析针灸干预 IBD发生发展的作用机理,揭示针灸调节作用的分子基础。目前尚未检索到miRNA与中国人炎症性肠病的关系及针灸干预作用的相关文献报道。今后,可对中国人炎症性肠病进行miRNA的筛选、鉴定,初步明确中国人炎症性肠病相关的miRNA,了解中国人炎症性肠病相关的miRNA表达特点,找出中国人溃疡性结肠炎和克罗恩病发病的关键 miRNA及其靶基因,并运用生物信息学技术进行分析,构建 miRNA-mRNA的共表达网络,对其参与的主要生物学功能和信号通路进行整合分析。并在此基础上,观察艾灸对于 miRNA及其靶基因的调节作用,运用生物信息学方法找出关键的信号通路中有显著性差异的miRNA和 mRNA,继而在细胞模型和动物模型上过表达和低表达相应的 miRNA,报告基因载体系统观察其靶基因的表达状况,明确miRNA的调节靶点,进而阐释艾灸的治疗机理。可以预见,引入miRNA技术研究针灸对IBD的调节机制,将传统的中医针灸与现代科学技术手段有机结合,将有助于全面、深入地揭示中医针灸调节IBD的作用机制,必将推动IBD基础研究和临床治疗的深入发展。

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