人乳头瘤病毒与宫颈癌关系的研究进展

张志勇 综述,施桥发 审校

(1、江西省人民医院检验科，江西 南昌 330006；2、南昌大学医学院基础免疫学教研室，江西 南昌 330006)

乳头状瘤病毒首先于1907年在人类疣中发现，1983年Richard Shoppe 首先从兔中分离出乳头状瘤病毒。在19 世纪70年代前，子宫颈癌长期以来被认为是一种性传播因子引发的疾病[1]，直至1972年，德国科学家Zur Hansen 在对宫颈癌风险因素探索研究的基础上首次提出宫颈癌可能由HPV 感染引起，从而引起了学者对HPV的深入研究。近几十年来的研究表明，高危型HPV 从肿瘤的启动、发生、发展及恶性表形的全过程都密切相关，是与人类肿瘤关系最为密切的肿瘤病毒。本文就其最新的研究进展作一综述。

1 生物学特性

1.1 HPV的分子生物学特性 乳头瘤病毒(papilloma virus,PV)是一组无包膜的小DNA 病毒，属乳头瘤病毒科，可感染人和多种高级脊椎动物的皮肤及黏膜上皮组织，其中感染人类的称为人乳头瘤病毒(Human pap;lilloma virus,HPV)。HPV 通常为直径52～60nm的正十二面体结构，病毒颗粒含有一条约8kb 碱基对双链DNA,外包以病毒衣壳。所有的HPV 基因组均有8个开放读码框架，8个开放读码框架仅从一条DNA 上译码，HPV 基因组从功能上分为三部分：(1)早期区，编码E1-E7 蛋白，是病毒复制的必需部分；(2)晚期区，编码L1和L2 蛋白，是病毒组装所必需部分；(3)长调控区(LCR)，其中包括病毒复制和转录所需要的多个cis 元件。

1.2 HPV的分型 讫今为止，已分离出不同基因型的HPV 达100个以上，其中超过40种可以感染肛门、生殖道或其他部位的内皮或黏膜上皮。根据HPV与诱发上皮组织增生的恶性程度不同，可以将其分为低危型HPV，包括HPV6、11、42、43等，通常引起生殖器湿疣、尖锐湿疣和非恶性病变[2]，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等类型，通常引起重度非典型性增生与宫颈癌。但大多数情况下，机体的免疫系统能在HPV 感染引发肿瘤之前将其清除[3]，仅有少部分高危型HPV 感染者发展成恶性肿瘤。

2 HPV 感染的流行病学情况

有关HPV 感染率的研究，由于检测标本的来源、使用的HPV 检测技术、检测的HPV型别及研究地区人群的不同，各研究的HPV 感染阳性率各有不同。美国2006年调查显示，美国有2 千万HPV 感染者，每年新发感染有62万[4]，其中女性比男性要高2倍。WHO/IARC 于2004年至2005年在我国对不同地区3000个不同年龄段的妇女进行的HPV 患病率调查显示[5-7]，中国妇女HPV 感染率在15%以上。

HPV 感染一般来说是通过生殖道接触传播。影响HPV 感染率的因素有多种，性行为是最主要因素，有研究显示有多个性伴侣的人在其一生中HPV 感染率为20.1%，同时只有一个性伴侣的人群感染率为7%[8],其他包括吸烟、长期使用激素类避孕药和性病史也是影响HPV 感染率的重要因素[9，10]。研究表明，大约有90%的HPV 阳性组织在2年内转为阴性[11]，10%以下的感染个体的宫颈上皮出现异常增生，但大多数处于平稳期。虽然大部分妇女在其一生中都至少感染一种HPV 亚型，但是这些感染人群患子宫颈癌的风险有多高目前尚不清楚，它取决于个体感染HPV的型别及机体的免疫功能。人乳头状瘤病毒不仅影响到妇女，甚至感染男性。HPV也能在男性之间进行传播，有文献报道，男同性恋者中肛门HPV 感染率高，发生HPV相关肛门癌的危险性也高[12]，但以收集男性标本做HPV-DNA的敏感方法最近才得到发展，所以对于男性HPV的感染因素及其自然史，目前还缺少相关资料。

3 HPV 致子宫颈癌的主要机制

自Zur Hansen 在子宫颈癌患者中发现HPV16和HPV18 以来，世界各国科学家研究发现除HPV16和HPV18外，另有HPV31、HPV34等14种型别的HPV可在人的生殖器、鼻咽部、食道等部位引发恶性肿瘤，并在其恶性肿瘤组织中检测出较高的HPV 感染率，并且存在与导致宫颈癌相似的致癌机制[13]。

对高危性HPV 如何引起子宫的恶性变化最终诱发子宫颈癌这一课题，科学家利用分子生物学、免疫学和遗传学的技术方法进行了深入的研究。在体内和体外研究均表明，HPV与宫颈癌的关系最重要三个致癌基因为E5、E6、E7[14]。E5 蛋白能与多种细胞生长因子受体结合，通过活化多种细胞因子的受体信号通路刺激细胞增殖[15],它对于病毒的DNA 整合到宿主基因组这一个肿瘤启动的关键步骤发挥了重要作用。E6 蛋白通过E6-AP的介导与P53 抑癌基因蛋白结合，在E6-Ap-ubiquitin蛋白酶的作用下，促使P53 蛋白进入泛素依赖的降解途径，改变G1期进入S期的调控点，细胞进入S期，导致突变增加、DNA的完整性受损。而且P53的降解还导致抑癌基因的功能降低，同时启动细胞周期，抑制细胞凋亡。E6 还作用于其他蛋白，包括点状粘蛋白paxillin和干扰素调节因子3，E6蛋白与干扰素的作用阻断了病毒对INF-β 诱导作用[16]。E6 还可使恶变的细胞对于TNF-α 介导的AP 复合物的改变不产生反应[17]。而E7 蛋白则与细胞RB 基因蛋白及其相关蛋白的相互作用，随继从RB 基因复合物释放出EF2 转录激活因子，E2F可与DNA 结合，活化促进细胞增殖相关基因的表达，使细胞过度增殖，最终导致细胞的永生化或肿瘤的发生[18，19]。总之，HPV与宿主基因整合、HPV 对细胞周期与细胞凋亡的影响、原癌基因和端粒酶的活化，被认为是HPV 诱发子宫颈癌变的关键因素。

4 HPV的检测方法

研究表明，99.7%的浸润型宫颈癌中可检测到HPV的存在[20]。HPV 检测对宫颈癌的诊断与预防有着重要意义，目前在医院和实验室已开展多种实验项目对HPV 进行检测，其常用检测方法如下。

4.1 巴氏涂片细胞病理学检测

凹空细胞是HPV 感染的主要形态学改变，在宫颈移行区取材进行巴氏染色可见由HPV 引起的凹空细胞，即可诊断。近年来随着技术的进步，传统的巴氏涂片法发展为液基薄层细胞技术(Thinprep cytologic test，TCT)和涂片自动检测系统[21]。TCT 操作标准化，人为影响因素较少，其检测的准确度高于传统的巴氏涂片法，目前在临床上已规模用于普查和筛查[22]，但由于其他病毒感染和人为因素均可造成细胞内凹空性变，加之取材、染色以及人为主观判断的影响，TCT 法检测HPV 仍存在灵敏度较低、特异性不高的缺点，此外也不能进行HPV 分型。

4.2 分子生物学法

4.2.1 PCR 检测HPV-DNA 以基因扩增为基础检测HPV-DNA，是目前灵敏度最高的检测方法。PCR 不仅可以应用于检测病毒负荷定量、DNA 测序、突变分析，还可用于多重扩增，同时检测多个DNA 序列。PCR 具有操作简单，标本来源不受限制等特点，因此PCR 检测是目前进行HPV-DNA 检测及分型的最好办法[23]。但是高灵敏性导致它容易由于标本的污染而导致假阳性结果，而且在进行HPV 分型时一次性检测的样本数目有限，限制了其在大规模筛查中的应用。PCR 法包括型特异性PCR 检测、实时荧光定量PCR 检测(FQ-PCR)、通用引物PCR 检测等。

4.2.2 PCR 产物分型检测 通用引物PCR的扩增产物可用直接测序法、限制片段长度多态性分析(RFLP)、杂交分析、基因芯片实现基因分型。直接测序法是HPV 检测的金标准，能检测到所有的型别，并可避免杂交反应所固有的交叉反应，对检测出新发现的型别有着重要作用，但是混合感染时，可能一种型别占绝对优势，这就无法辨别出含量少的型别，造成假阴性，将混合型判定为单一型[24]。RFLP 是选择合适的限制性核酸内切酶，并根据特定的酶切条带模式判断HPV型别。杂交分析是最常用的检测PCR 产物的方法。杂交法敏感度高，并对多重感染的检测能力较高，可以判断HPV的多重感染及型别，目前常用于HPV型别分布的统计中[25]。但其缺点是只能用于检测已知的某些常见型别，对未知型别及变异型的HPV 不能检测,而且不能排除交叉杂交的可能性。基因芯片是采用原位合成或显微点样技术将DNA 探针固化于支持物表面，产生二维DNA 探针阵列，然后与标记的样本进行杂交，通过检测杂交信号来实现快速、高效的检测。基因芯片杂交可实现一次性对大批量标本进行检测分析，具有通量高、速度快、信息量大、所需样本少、污染少等特点。研究显示基因芯片的灵敏度和特异性较其他方法高，其敏感性高达96.0%[26]。但目前基因芯片技术的成本昂贵，如在将来能降低其技术成本，将有广阔的发展前景。

4.2.3 杂交捕获法 杂交捕获法是利用两套全长RNA 探针与HPV 核酸杂交，再通过抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测，来确定HPV 存在与否。根据此法，美国Digene 公司先后开发出HCⅠ、HCⅡ、HCⅢ、HC Express Array等几代产品，其中HCⅡ是通过化学荧光法来定量检测病毒DNA，可同时检测13种高危型和5种低危型HPV型别，该技术敏感性好、重复性高，是目前唯一通过FDA批准的可在临床使用的HPV 检测技术[27]，但缺点是不能进行HPV 分型。HCⅢ用一段带有生物素的寡核苷酸代替HCⅡ中的特异性抗体，减少了非特异性造成的假阳性结果,但也不能进行HPV 分型。HC Express Array 技术则利用芯片上固定病毒不同亚型的特异性DNA 探针，对病毒DNA 进行分型判断，具有广阔的应用前景。

4.3 免疫学检测 主要是利用经重组技术表达的抗原来检测患者血清中相应的抗体，或抗原免疫动物制备免疫血清，或单克隆抗体检测组织或局部黏液中HPV 抗原。临床常用免疫吸附法检测HPV 中L1 类病毒颗粒的IgM和IgG 抗体以及HPV的E6、E7的特异性抗体蛋白等。另外也可利用免疫组织化学法检测高危型HPV的早期基因蛋白E6、E7，早期基因蛋白的存在能有效的证明组织中存在HPV 感染。但由于血清学检测的对象是抗原和抗体，人体对HPV 感染产生免疫应答有一定的迟滞性，同时HPV 病毒不能在体外培养增殖，所以血清学检测对无免疫应答者和HPV 潜伏期感染者会产生漏检。

4.4 多种检测方法的联合应用 单一方法检测均有缺点，临床多采用联合多种检测方法以提高准确性。高娜等[28]研究发现，将HPV-DNA 检测和细胞学检查联合应用进行宫颈癌及CIN的筛查，其效率大为提高。而在筛查宫颈癌的最佳方案中，HCⅡ与细胞学联合检测是最佳方案[29]。

5 HPV 疫苗

5.1 HPV 疫苗的分型 HPV 疫苗可分为预防性和治疗性两种类型。HPV 预防性疫苗可阻断HPV 感染皮肤和黏膜，一般由病毒衣壳蛋白L1 或L1+L2组成，在细胞内可自我组装成空心病毒样颗粒(VLPs)[30]，它具有与完整病毒相同的抗原空间表位，可激发机体的CD4+淋巴细胞介导的体液免疫反应，刺激机体产生保护性中和抗体。预防型疫苗种类较少，主要以HPV 病毒的结构蛋白质形式存在，其不含病毒DNA和癌蛋白，因而具有较高的免疫原性和安全性。随机临床试验显示，预防性HPV 疫苗对治疗HPV 感染是有效的[31,32]。

HPV治疗性疫苗可清除由HPV 感染所引起的肿瘤残存病灶、宫颈不典型增生(CIN)及生殖器尖锐湿疣，阻断低危型病变向高危型病变及癌症的转变过程。治疗疫苗多将E6和E7 蛋白作为靶抗原，理想的治疗性疫苗可以使机体产生HPV 特异性细胞毒性T细胞(CTL)。目前研究的治疗性疫苗主要有重组牛痘病毒疫苗、a 病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗、细菌载体疫苗、基因疫苗、肽段疫苗、p16INK4a 疫苗、融合蛋白疫苗和细胞疫苗等。

5.2 HPV 疫苗的现况 目前，应用较为广泛的HPV疫苗主要是预防性疫苗，主要有2种[33]：一种是美国默克公司生产的针对HPV 6型、11型、16型、18型的四价疫苗Gardasil，另一种是葛兰素史克公司生产的针对16型和18型二价体疫苗Cervarix，二者分别于2006年6月和2009年10月通过美国FDA的批准。疫苗最佳注射时间是在首次性生活之前，两种疫苗最早可接种年龄为9岁，疫苗的有效期在5年以上，临床试验结果证明其均有良好的耐受性，且没有严重的不良反应，抗体效价比自然感染HPV的患者高50倍[34，35]。

5.3 HPV 疫苗存在的问题及展望近几十年来，人们在宫颈癌发病机制以及宫颈癌预防和治疗方面取得了很大的进展，HPV 疫苗的发明为通过接种预防宫颈癌提供了可能。预防性HPV 疫苗Gardasil和Cervarix 在一些国家和地区得到了较为广泛的应用，但在某些国家和地区针对是否将其纳入常规接种计划尚有争议。预防性HPV 疫苗在预防HPV 感染和CIN 方面有高效性，在安全性方面在一定程度上也可得到保证。但HPV 预防性疫苗只能预防疫苗亚型范围内的HPV 感染，对疫苗范围外的亚型感染没有保护作用，对已经感染此种HPV 亚型的女性也没有保护作用。在我们国家，宫颈癌的发生率相对较高,引起宫颈癌最常见的高危亚型是52、58型，目前国际上市的两种HPV 疫苗均未针对其，因此相应的HPV 疫苗也没有在国内上市，我们仍然需要通过筛查来尽早发现宫颈病变。尽管目前疫苗存在一些问题，但是随着该领域研究的发展，问题终将得到解决。

综上所述，HPV与宫颈癌的发生、发展、预防和治疗都有密不可分的关系。针对目前研究中存在的问题，我们应进一步加强对HPV 感染与宫颈癌关系的研究，研制出针对性的人乳头状瘤病毒疫苗，使人类最终免受宫颈癌及其它HPV 相关疾病的危害。

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