流式细胞仪计数造血干细胞的影响因素

苏炳男，彭明婷

(北京协和医学院研究生院 卫生部北京医院 卫生部临床检验中心，北京 100730)

造血干细胞移植因其操作简便，能快速重建造血和肿瘤细胞污染发生较少等优点，已被广泛用于治疗多种恶性血液系统疾病、实体肿瘤、遗传性疾病、重症联合免疫缺陷病等顽疾[1]。移植物中和患者体内的造血干细胞数量对造血干细胞移植有重要的临床意义，如决定造血干细胞的最佳采集时机、评判采集效果以及预测移植成功率等[2,3]。

早期一般使用检测粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的方法来间接反映移植物中的造血干细胞数量及增殖能力。但是其结果变异性大，耗时长(至少14d)，不利于临床应用[1]；单克隆抗体结合流式细胞仪计数CD34+细胞具有检测快速、结果定量并可同时检测CD34+细胞亚群等特点，现已被广泛应用。Bittencourt等人研究发现，移植物中CD34+细胞数大于3×106/kg的患者与小于3×106/kg的患者相比较，其移植相关累计死亡率低(19% vs.37%)，术后存活率高(64% vs.40%)[2]。而且，保证移植物中足够的CD34+细胞数量还可以降低医疗花费。一项对1317份外周血采集物的调查研究显示，移植物中CD34+细胞数大于5×106CD34+/kg的患者与小于5×106CD34+/kg的患者相比较，其平均住院时间短，抗生素、抗菌素和重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)的平均使用量少，平均输血次数少，因此每名患者平均可节省约3726 美金的医疗花费[3]。

因送检的标本中CD34+细胞的数量非常少(0.1～3%)，且流式细胞仪计数CD34+细胞过程中对结果产生影响的因素较多，各实验室间结果存在很大的变异性。卫生部临床检验中心在2007年进行的流式细胞仪计数CD34+细胞室间质量评价项目的结果显示，35家实验室的相对计数结果变异性约为30%，绝对计数结果变异性约为50%。多篇国外文献显示，影响流式细胞仪计数CD34+细胞结果的主要影响因素有：分析方法、实验室检测技术及经验、检测设备、抗体及荧光素和标本处理过程[4-12]，控制这些影响因素可以有效地降低结果变异性。本文将对这些影响因素逐一阐述，并尝试探讨质量控制方法及规范的检测程序。

1 分析方法

1.1 单/双平台法 双平台法绝对计数结果的变异性要比单平台法的变异性大[4-7]。双平台法绝对计数结果来源于流式细胞仪和血细胞分析仪：流式细胞仪获取CD34+细胞百分率，血细胞分析仪计数白细胞(有核细胞)绝对浓度，这两个结果相乘所得即为CD34+细胞绝对浓度；单平台法绝对计数结果仅靠流式细胞仪即可获得：CD34+细胞的绝对浓度可以间接地通过加入的已知浓度的荧光微球数来计算。Sutherland等人的研究显示，单平台法避开了计数结果中分母(有核细胞总数)的影响，即不受血液分析仪结果变异性的影响，所以其CD34+细胞计数结果变异性较小[8]。根据卫生部临床检验中心2007年对国内107家实验室进行的调查显示，仅有10家实验室使用了单平台计数法。这可能是室间质量评价绝对计数结果变异性大于相对计数结果变异性的主要原因。尽管单平台法成本较高，对检测人员要求较高，但使用单平台法计数CD34+细胞可以更有效地降低实验室间绝对计数结果的变异性[7]。

1.2 分析方案 目前大多实验室使用的是在国际上被认为最具准确性和稳定性的ISHAGE 方案。Sutherland 于1994年在他的研究中使用这种方法进行分析，随后这种方法被ISHAGE(International Society for Hematotherapy and Graft Engineering)收录作为推荐方案使用，旨在确立一个普遍通用的，可有效排除实验室内或实验室间差异的方案。该方案通过逻辑设门的方法排除干扰细胞，精确有效地计数CD34+细胞[9]。研究显示，相比于ISHAGE方案，其他分析方案获得的计数结果较低。例如，Milan 方案通过FSC和SSC 双参数散点图设门来确定作为分母的白细胞数。但是较低的FSC 阈值不能完全排除碎片、红细胞和血小板，造成结果的分母偏大。而且该方案仅分析CD34 强阳性细胞，不分析弱阳性细胞，这也是造成该方案得到的计数结果较低的原因[5]。根据卫生部临床检验中心2007年对国内107家实验室进行的调查显示，仅有57家实验室使用了ISHAGE 方案计数CD34+细胞；而根据英国国家实验室间质量评价机构(United Kingdom National External Quality Assessment Service,UK NEQAS) 对101家实验室的调查显示，有80%的被调查实验室都选用ISHAGE 方案，但是这些实验室并不都能够正确地使用该方案分析标本：其中仅有57%的实验室在分析过程中正确无误地使用了该方案，其余的实验室在使用该方案时都出现了一些错误，比如漏门、门的设置有误等[10]。推广并正确地使用ISHAGE 方案是提高我国实验室计数CD34+细胞准确性及稳定性的重要措施。

2 实验室检测人员技术及经验

实验室检测人员的技术及经验会对CD34+细胞计数结果产生影响。Guttridge等人的研究发现，技术熟练，经验丰富的检测人员可以准确地移取试剂和标本，所以能够得到更加准确且稳定的CD34+细胞计数结果[11-13]。Levering等人对不同实验室进行比较后发现，一些实验室很少，甚至不参加权威机构组织的室间质量评价及质量改进项目，导致检测人员经验不足，计数结果与其他实验室差异较大[7]。根据卫生部临床检验中心2007年对107家实验室的调查显示，尽管有90余家实验室表示参加过设备厂家组织的培训，但由于设备、试剂及培训人员水平不同，厂家培训并不规范。我国目前也没有权威机构开展该项目规范统一的培训。为保证计数结果的准确性和可比性，临床实验室应该参加权威机构开展的室间质量评价及质量改进项目，权威机构应开展此项目规范统一的培训，提高检测人员技术及经验。

3 检测设备

不同品牌、不同型号的流式细胞仪得出的检测结果有差异。2007年卫生部临床检验中心对107家实验室的调查显示，有54家实验室使用FACSCaliburTM，31家实验室使用Epixs XLTM，18家实验室使用FACScanTM，5家实验室使用CytoronTM。Wilfried等人的研究显示，与FACScanTM和Epixs XLTM这2种流式细胞仪相比，FACSCaliburTM和CytoronTM获得的相对和绝对计数结果均较高，但CytoronTM的结果变异性大[7]。任何一台流式细胞仪，保证其稳定的状态及合适的参数，是获得准确计数结果的前提。应使用荧光微球监控流式细胞仪光路和液路的性能及状态，并设定合适的参数靶值范围。在计数CD34+细胞前，要使用FITC/PE荧光微球调节荧光补偿。设置好相关条件后，使用造血干细胞计数质控物来验证荧光补偿是否合适，并调节电压。在接受调查的107家实验室中有17家没有使用光路流路校准品、PMT 电压校准品以及颜色补偿校准品。而且由于进口造血干细胞计数质控品价格昂贵，有效期短，国内没有相关质控品，有9家实验室没有使用质控品。使用流式细胞仪校准品及造血干细胞计数质控品，保证流式细胞仪性能和状态，是获得准确稳定的CD34+细胞计数结果的重要前提。

4 抗体及荧光素

4.1 抗体 不同的抗CD34 抗体得到的CD34+细胞计数结果也不同。根据结合的CD34 抗原位点的不同，抗CD34 抗体可以分为三类。结合I 类抗原位点的抗体在与荧光素结合后，其结构发生改变，抗体失去活性，特异性也会严重下降。而PE 标记的针对Ⅱ类抗原位点的抗体能够检测标本中所有CD34+细胞，但它一旦与FITC 结合后也会丧失一部分结合能力。现普遍推广使用与III 类位点结合的抗体，这类抗体能有效地与多种荧光素结合，如FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5，而且能够检测标本中所有的CD34+细胞[7]。

4.2 荧光素 抗体结合的荧光素会对CD34+细胞计数结果产生影响。PE 荧光素是目前使用最广泛的与抗CD34 抗体结合的荧光素。与FITC 标记的抗体相比，无论是绝对计数还是相对计数，使用PE结合的抗体得到的结果明显更高。Levering等人的研究显示，其原因是PE 有更强的荧光信号，可以更好的区分阳性和阴性细胞[7]。所以使用流式细胞仪计数CD34+细胞的最理想荧光素为PE 标记的抗体。

5 标本处理过程

5.1 标本保存温度和时间 标本的保存温度和时间对标本细胞状态有影响，进而影响CD34+细胞计数结果。Gutensohn等人就保存温度对标本的影响的研究发现，外周血采集物在室温条件下保存超过24h 后，CD34+细胞数量下降了约1/4；而在4℃条件下保存的标本，CD34+细胞数量没有明显下降[14]。Szolomicka-Kurzawa 就保存时间对脐带血的影响的研究发现，4℃条件下保存的脐带血在离开人体内环境的24h 内，其CD34+细胞数目和状态可保持稳定，增殖能力良好，而48h 以后其细胞状态及增值能力明显下降[15]。在美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的流式细胞仪分析计数操作指南文件中，对不同类型抗凝剂/保存液保存的新鲜标本可以保证计数准确可靠的时间进行了说明：EDTA 保存的标本要在12～24h 之内分析计数，肝素和ACD 保存的标本要在48～72h 之内分析计数[16]。实验室收到标本后，为保证结果的准确可靠，应立即进行检测；若不能及时检测，需将标本置于4℃条件下保存，并在CLSI 文件推荐的时间内进行检测。

5.2 溶血素 不同种类的溶血素对流式细胞仪计数CD34+细胞结果会造成影响。根据Bossuyt等人的研究发现，6种不同的溶血素 (①FACS Lysing Solution; ②Immunolyse Leucocyte Preparation System; ③ImmunoPrep Leucocyte Preparation System;④Optilyse B Lysing Solution；⑤Ortho-mune Lysing Reagent; ⑥ACK Lysing Buffer.)的效果各不相同。虽然所有的这些溶血素都能使CD34 阳性细胞明显地与阴性群体区分开，但是使用Ortho-mune Lysing Reagent和ACK Lysing Buffer 两种溶血素得到的结果大约要比使用其它溶血剂的结果高10%[17-19]。

5.3 标本是否洗涤 溶血后不洗涤的标本与溶血后洗涤的标本相比，其CD34+细胞绝对计数结果更高。Levering等人的研究发现，标本中CD34+细胞数量一般很少，洗涤会导致细胞丢失，对结果有很大的影响。而不洗涤的标本中较多的细胞碎片、杂质，可以通过合理的设门来排除[7]。

6 小结

保证造血干细胞计数结果的准确性和稳定性十分重要，但该项目影响因素较多，结果变异性较大。使用单平台ISHAGE 方案进行检测分析是最有效的降低结果变异性的方法。其次，实验室应积极参加权威机构开展的室间质量评价及质量改进项目，保证仪器性能状态，提高检测人员技术及经验。另外，检测时应严格控制使用的试剂及标本处理过程。

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