初培养结合PCR检测精液解脲脲原体感染的临床应用

王建华，王卫国，钱亚东，张红安

(阜阳市人民医院，安徽 阜阳 236006)

初培养结合PCR检测精液解脲脲原体感染的临床应用

王建华，王卫国，钱亚东，张红安

(阜阳市人民医院，安徽 阜阳 236006)

目的探讨初培养产物结合PCR方法检测精液解脲脲原体感染应用价值。方法选取120例不育症患者的精液，分别用PCR、培养加药敏试剂盒、初培养产物结合PCR的方法检测解脲脲原体，并与分离培养结果相比较。结果120例精液分离培养出62例解脲脲原体，使用PCR法检测出30例阳性、用培养加药敏试剂盒检测出65例阳性、用初培养产物结合PCR技术检测出62例阳性，以上三种方法与分离培养结果的总符合率分别为73.3%、97.5%和100%。结论初培养产物结合PCR是一种检测精液解脲脲原体的可行性方法。

解脲脲原体；PCR；培养；精液

解脲脲原体是是人类泌尿生殖道最常见的寄生菌之一，可以引起多种疾病，若上行感染引起男性前列腺炎或附睾炎，可导致不育症的发生[1，2]。目前检测生殖道解脲脲原体的方法基本上采用PCR或培养加药敏试剂盒，由于精液相对于其他生殖道标本，较为特殊，目前这两种被广泛采用的方法对于检测精液中解脲脲原体是否合适，相关报道极为少见。为此，我们通过PCR、培养加药敏试剂盒以及初培养产物结合PCR方法检测精液中解脲脲原体，并与分离培养结果(当前实验室检测解脲脲原体的“金标准”)相比较，分析何种方法更适合检测精液中的解脲脲原体。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2011年5月至2011年7月就诊于阜阳市人民医院生殖科的120例男性不育患者精液，年龄18～47岁，所选对象无梅毒、淋病、尖锐湿疣、生殖器疱疹，无细菌性尿路感染，无衣原体和人型支原体感染，无艾滋病毒感染。所选患者在检测前禁欲5d，标本采集前排空尿液，消毒外尿道口，收集所有的精液于无菌的容器中，立即送检。

1.2 试剂和仪器 PPLO培养基(上海博华生物科技有限公司)，马血清(广州蕊特生物科技有限公司)，解脲脲原体荧光定量PCR试剂盒(广州达安公司)，生殖道支原体培养和药敏检测试剂盒(郑州安图生物有限公司)，瑞姬染液(广州伟伯化工有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 PCR直接检测 取充分混匀精液100 μl，加入无菌生理盐水1 ml洗涤2次，15 000r/min离心10 min，留取沉淀物，加入100 μl的DNA提取液，100℃加热10min，取上清2μl作为PCR检测模板，荧光定量PCR检测按检测说明书进行。

1.3.2 培养加药敏试剂盒检测 加入100 μl培养液于阴性对照孔后，加入100μl精液于培养液内，混匀后用100μl移液器分别加入各培养孔，液体石蜡封闭；剩余培养液勿弃，加入液体石蜡后盖紧瓶盖同培养板相同条件培养，37℃培养48h后观察结果，。各培养孔不变色为阴性，对照孔和鉴定孔变为红色而计数孔没有变色，表明感染量小于104CCU/ml，若对照孔、鉴定孔及计数孔都变红色，表明感染量≥104CCU/ml。

1.3.3 初培养产物结合PCR检测 取方法(1.3.2)的培养产物100 μl，15 000r/min离心沉淀，无菌生理盐水洗涤2次，留取沉淀物，提取DNA，荧光定量PCR检测按检测说明书进行。

1.3.4 解脲脲原体分离培养 取100 μl精液加入到以PPLO肉汤(内配有马血清、酵母浸液、尿素等)中，5%CO2、37℃培养24～48h，观察培养液颜色变化，由黄色变成红色时，即判为阳性。阳性样本转种于新的液体培养基和相应的固体培养基上，置于微厌氧环境中作次代培养，以放大镜观察菌落形态，同时将液体培养物离心后涂片，作姬姆萨染色。

1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0软件，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所选120份精液样本，有62例分离培养出解脲脲原体，用PCR直接检测标本，共检测出30例阳性，与培养分离结果比较，阳性符合率48.4%，阴性符合率为100.0%，总符合率为73.3%，用培养加药敏试剂盒检测出65例阳性，与培养分离结果比较，阳性符合率100%，阴性符合率为94.8%，总符合率为97.5%，用初培养产物结合PCR检测出62例阳性，与培养结果比较，阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。培养加药敏试剂盒方法与初培养结合PCR法检测解脲脲原体的阳性率差异无统计学意义，但明显高于PCR直接检测的结果(P＜0.05)。

3 讨论

解脲脲原体是人类泌尿生殖道最常见的微生物之一，正常情况下，与宿主共存，不表现感染症状，但在特定的条件下可以引起机会性感染。解脲脲原体感染后，可产生侵袭性酶如磷脂酶等，破坏宿主细胞膜上的磷脂，阻碍宿主细胞的生物合成，也可产生尿素酶，生成代谢产物氨，直接对宿主细胞产生毒性作用，同时产生IgA蛋白酶，破坏泌尿生殖道黏膜局部的抗感染能力，由此导致泌尿生殖道感染性疾病的发生。解脲脲原体感染可以引起睾丸附睾炎、慢性前列腺炎，由于解脲脲原体可吸附于精子表面，阻碍精子运动，产生的神经氨酸酶样物质干扰受精过程，而且其与精子存在共同抗原，引起机体对精子的交叉反应，造成免疫损伤，故解脲脲原体感染是男性不育症的常见原因之一[2，3]。

由于精液相对于其他标本如泌尿生殖道分泌物、中段尿，较为特殊，一方面精液成分非常复杂，对检测方法的干扰因素多，另一方面留取精液的过程较为繁琐，标本极易受到污染，会导致检测的假阳性结果。当前对解脲脲原体检测的常用方法是PCR、培养加药敏试剂盒，这两种方法对检测精液解脲脲原体的适用性，报道较少。本实验发现，用PCR直接检测精液解脲脲原体，与分离培养结果比较，阳性符合率仅为48.4%，说明此法的灵敏度不够。由于精液中存在黏蛋白、免疫球蛋白、蛋白酶、脂类和多糖等物质，这些物质均是PCR反应抑制物，而且煮沸法提取精液DNA时，并不一定能使DNA与结合蛋白完全分离，这些物质还可能对DNA产生物理包裹作用，不能使其与DNA聚合酶接触，导致PCR扩增检测的灵敏度降低，虽然在检测过程中对精液的洗涤可以部分减少PCR抑制物，但也很有可能造成解脲脲原体的丢失，所以造成PCR直接检测精液中解脲脲原体的灵敏度不足。我们用培养加药敏试剂盒检测时发现，有3例标本产生假阳性，说明此法的特异性不很理想，由于这种类型的试剂盒，均利用解脲脲原体分解精氨酸或尿素使培养基发生颜色变化，来判断其生长与否，由于精液在留取过程中条件难以控制，标本很可能受到细菌污染，而且非淋球菌性泌尿生殖道感染大部分都是混合感染，虽然培养基中加入了青霉素、醋酸铊等抗生素，破坏细菌的细胞壁防止杂菌生长，但不能抑制革兰阴性菌增殖，并且当前微生物对抗生素的抗性越来越强[4-7]，很有可能造成假阳性结果。本实验利用初培养产物结合PCR的方式检测精液中解脲脲原体，与培养分离结果相比，完全符合，由于经过初培养和洗涤后，PCR抑制物会急剧减少，同时利用PCR检测的特异性对培养物再次鉴定，整个方案简单易行。

本实验证明，PCR技术直接检测精液中的解脲脲原体并不合适，而当前使用最为广泛的培养加药敏试剂盒，虽然灵敏度很好，但有一定的假阳性，对临床诊断可能会造成一定的误导[6]，培养分离的方法操作复杂，条件要求高，并不适用于临床实验室，以前使用的血清学方法已被证明意义不大，而本实验所采用的初培养产物结合PCR方法能较好解决精液解脲脲原体感染的诊断，简单易行，值得临床应用。

[1]Zhu C,Liu J,Ling Y,et al.Prevalence and antimicrobial susceptibility of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis in Chinese women with genital infectious diseases[J].Dermatol Venereol Leprol,2012,78(3):406-407.

[2]Salmeri M,Valenti D,La Vignera S,et al.Prevalence of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis infection in unselected infertile men[J].Chemother,2012,24(2):81-86.

[3]刘春利，苏玉芬，阮学雨，等.解脲脲原体感染引起不育的检测分析[J].检验医学与临床，2008，5(2)：78-79.

[4]郑 勇，高绪锋，张松涛，等.680例女性泌尿生殖道支原体和沙眼衣原体感染及耐药性分析[J].实验与检验医学,2012,30(1):65-66.

[5]刘泽虎，周渭珩，洪为松.临床分离的解脲脲支原体耐药性的变迁[J].中华医院感染杂志，2006,16(1)：114-117.

[6]汤 幽，廖秋兰.支原体感染及耐药分析[J].实验与检验医学,2010,28(1):90.

[7]谢逢春，郑芳英，马 骥，等.支原体对十二种抗生素的耐药性连续三年监测结果分析[J].实验与检验医学,2010,28(2):187-188.

Initial culture binding PCR assay for the detection of infection of Ureaplasma urealyticum in semen

WANG Jianhua,WANG Weiguo,QIAN Yadong,et al.Department of Clinical Laboratory,The People's Hospital of Fuyang,Anhui Fuyang 236006,China.

ObjectiveTo explore the applied value of using initial culture binding polymerase chain reaction(PCR)assay for the detection of infection of Ureaplasma urealyticum in semen.MethodsThe semen samples were collected from 120 sufferers with sterility,Ureaplasma urealyticum were detected by 3 methods:PCR,culture,initial culture binding PCR,respectively,and the results were anglyzed.ResultsOf the 120 samples,Ureaplasma urealyticum were isolated in 62 cases by isolation and culture,positive in 30 cases by PCR,positive in 65 cases by culture and drug susceptibility kit,and positive in 62 cases by initial culture binding PCR.Compared with isolating culture method,the coincidence was 73.3%,97.5%and 100%respectively.Conclusion Initial culture binding PCR is a kind of feasible means to detect Ureaplasma urealyticum in semen.

Ureaplasma urealyticum;Polymerase chain reaction;Culture;Semen

R446.5,R375+.3

B

1674-1129(2012)04-0361-03

王卫国

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.017