MiR-200a在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

徐韶华,程文俊,许培箴

(1.南京医科大学附属常州市妇幼保健院妇瘤科,江苏常州,213003;2.南京医科大学第一附属医院妇科,江苏南京,210029)

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,死亡率居女性恶性肿瘤之首,5年生存率不超过40%,70%的卵巢癌发现已属晚期[1]。因此,探索卵巢癌发生发展的分子机制及寻找早期诊断的指标一直是卵巢肿瘤研究的热点。越来越多的研究表明,miRNA在许多恶性肿瘤中存在异常表达,其通过调控靶基因而影响肿瘤的发生、发展、侵袭转移,发挥类似癌基因或抑癌基因的作用[2]。miRNA在卵巢癌中的异常表达也被越来越多的研究证实,主要集中在miRNA-200家族中。但是miR-200a在卵巢上皮癌中的表达,不同研究组的结果并不一致。为此,本研究采用Taqman探针实时荧光定量PCR方法检测上皮性卵巢癌组织中miR-200a的表达,分析miR-200a与临床病理特征之间的关系,探讨miR-200a在卵巢癌发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象

组织标本来自2008年1月～2011年1月在南京医科大学第一附属医院妇科和南京医科大学附属常州市妇幼保健院妇瘤科行手术治疗的上皮性卵巢癌患者40例,术前均未接受放疗、化疗,术后均经病理确诊。患者年龄28～72岁,平均53岁。按国际妇产科联盟(FIGO)的分期标准,Ⅰ期6例、Ⅱ期 10例、Ⅲ期 22例、Ⅳ期2例。病理分级:G1 10例、G2 13例、G3 17例。另取同期年龄匹配的良性上皮性卵巢肿瘤组织30例做对照。所有标本离体后10min内置于液氮内保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取:采用T RIzol法提取组织总RNA,方法按照说明书进行。RNA经1%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行质量控制并进行浓度测定。D260/D280比值在1.7-2.0者用于后续实验检测。

1.2.3 反转录:用Taqman miRNA反转录试剂盒和miRNA特异性茎环结构(stem-loop)反转录引物进行miRNA反转录反应,操作参照ABI公司实验流程进行,进行部分调整。总反应体系为 15 μ L 。 包括 3 μ L 5 ×反 转录引物 、0.15 μ L 100 mmol/L dNTP和dT TP混合物、1 μ L反转录酶(50 U/μ L)、1.5 μ L 10 ×反转录缓冲液 、0.19 μ L RNA 抑制剂,共5.84 μ L。将上述体系轻柔混匀,轻微离心。每个反应体系中加入 9.16 μ L RNA,吹打混匀,轻微离心。将混合好的体系在下列条件下进行反转录反应:16℃孵育2 min,42℃反应1 min,50℃反应1 s,上述3步经40个循环反应,再85℃孵育5 min。

1.2.3 实时定量RT-PCR检测miR-200a的表达:miRNA每个反应体系为5 μ L,其中包括1 μ L稀释后的 cDNA、0.25 μ L 20×miRNA 检测探针 、2.5 μ L 2 ×基因表达 Master Mix、1.25 μ L 双蒸水。每个miRNA检测配置3平行所需的体系,轻柔混匀,使用ABI Prism7900荧光定量PCR仪,PCR的反应条件:95℃5 min※95℃15 s,60℃1 min进行45个循环。原始数据用SDS 2.3软件进行初步分析。

以U6作为相对定量的内参,2-△CT为目的基因的相对表达量[△CT=CTmiR-200a-CT U6]。所有样本均重复3孔。

2 结 果

2.1 上皮性卵巢癌、良性上皮性卵巢肿瘤组织中miR-200a的相对表达量

miR-200a在上皮性卵巢癌组织中的相对表达量为0.0355(0.0043,0.3700),在良性上皮性卵巢肿瘤中的相对表达量为0.0017(0.0004,0.0047)。采用非参数秩和检验,两者之间差异具有显著性(P<0.01)。

2.2 miR-200a的相对表达量与上皮性卵巢癌患者临床病理特征的关系

miR-200a在早期卵巢癌组织(FIGOⅠ+Ⅱ)中的表达量0.1517(0.0047,0.6436)明显高于晚期卵巢癌组织(FIGO Ⅲ+Ⅳ)中表达量0.0207(0.0031,0.0939),差异具有统计学意义(P<0.05);在低分化卵巢癌组织中表达量为0.0386(0.0038,0.1257),明显低于高中分化卵巢癌组织中表达量0.1325(0.0045,0.5892),但差异不具显著性(P=0.1377);不同肿瘤类型、有无淋巴结转移的卵巢癌组织中表达量的比较,差异均无统计学意义。

3 讨 论

MicroRNA是一类大小为20-25核苷酸的非编码小RNA,其通过与靶mRNA 3′UTR区相结合导致靶基因的降解或翻译受抑制,从而调控基因的表达。最近研究表明,miRNAs与人类多种肿瘤的发生密切相关,已知50%的miRNAs基因位于肿瘤相关的基因组区域或者位于脆性位点,促进了肿瘤的发生和进展,其作用类似于癌基因或抑癌基因[3]。

miR-200a属于miRNA-200家族,其编码基因定位于染色体1p35.33。通过其5′末端种子序列AACACU与靶基因mRNA的3′端非编码区(3′UTR)部分碱基完全或不完全互补配对,负性调控基因表达。miR-200a在许多恶性肿瘤如胃癌[4]、肝癌[5]、甲状腺癌[6]、鼻咽癌[7]、肾透明细胞癌[8]中呈低表达,但在卵巢癌中的表达仍存在争议。Iorio等[9]通过微列阵芯片研究发现miRNA-200家族中的 miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141在卵巢上皮癌中均显著升高。Nam等[10]研究结果显示miRNA-200家族在卵巢癌中高表达且和卵巢浆液性腺癌的不良预后相关。Dahiya等[11]筛查了34例上皮性卵巢癌和10个卵巢癌细胞系,发现miR-21,miR-200a,miR-141,let-7表达下降。Hu等[12]发现miR-200a的低表达与晚期卵巢癌的术后复发及低生存率相关,并可作为判断卵巢癌预后差的指标。综合以上各家研究结果,miR-200a在卵巢癌中表达并不一致,分析存在差异的原因,可能和检测采用的方法,芯片,样本量不同有关。

本研究采用Taqman探针实时荧光定量PCR法检测发现miR-200a在上皮性卵巢癌中表达量显著高于良性上皮性卵巢肿瘤组织(P<0.01),与Iorio和Nam等研究结果一致,说明miR-200a的高表达是上皮性卵巢癌的重要特征。晚期卵巢癌中表达水平低于早期卵巢癌(P<0.05),但总体表达水平仍高于良性卵巢上皮组织,在低分化组织中表达有明显下降趋势,说明在晚期卵巢癌中miRNA-200a的表达下调可能参与了卵巢癌的恶性进展和转移。

许多研究表明肿瘤侵袭转移的关键步骤在于发生了上皮-间质细胞转化EMT(epithelial-to-mesenchymal transition),这种过程是指已分化的上皮细胞极性丧失获得了间质细胞的表型,降低了细胞间的黏附而易脱落发生移,肿瘤细胞经过EMT过程就获得了低分化、易侵袭和远处转移的特征[13]。E-cadherin是维持细胞间稳定的关键分子,其表达的丢失是发生EMT的重要标志,一些转录因子如ZEB1、ZEB2、Snail,可下调E-cadherin及上调间质来源的波形蛋白表达,从而引起EMT[14]。研究发现miRNA-200家族的靶基因之一是锌指样转录因子ZEB1和ZEB2,miR-200a通过 5′端种子序列(AACACU)与ZEB1/ZEB2 mRNA的 3′UTR互补结合,转录后抑制ZEB1/ZEB2基因的表达,从而负性调控E-cadherin的表达[15]。SM Park等发现miR-200a及其家族在表达E-cadherin的NCI60肿瘤细胞系中高表达,而在间质肿瘤细胞系中低表达或缺失,上调miRNA-200家族的表达能引起E-cadherin表达增高并抑制肿瘤细胞的迁移,相反,抑制miRNA-200家族的表达能明显降低E-cadherin的表达并诱导EMT,促进肿瘤细胞侵袭和转移[16]。Gregory等发现,microRNA-200家族在经TGF-β1诱导的乳腺肿瘤细胞发生EMT过程中下调,伴随着E-cadherin mRNA水平的降低以及ZEB1/2水平的大幅升高[17]。E-cadherin在卵巢癌发生发展中呈现复杂的时相性,在正常卵巢上皮表达极少,在早期卵巢癌中E-cadherin表达增加,一旦卵巢癌发生转移,E-cadherin表达显著减少[18-19]。

与上述研究结果一致,本研究发现miR-200a的表达在早期卵巢癌中先升高,而在晚期卵巢癌显著下降,亦呈现先高后低的时相性。其可能的机制是早期卵巢癌中miR-200a升高通过抑制其靶基因ZEB1/ZEB2的表达,上调E-cadherin的表达,在卵巢癌早期E-cadherin高表达可促进卵巢上皮细胞向恶性转化。晚期卵巢癌中miR-200a明显下降,其靶基因ZEB1/ZEB2的表达上调导致E-cadherin低表达,使肿瘤细胞低分化程度增加,促进EMT发生,肿瘤细胞间黏附功能丧失,从原发灶脱落,发生播散和转移。另外有研究发现miRNA-200家族和ZEB1/2之间存在一个双重负反馈环机制,miRNA-200家族通过转录后抑制ZEB1/2的表达,相反ZEB1/2也可通过抑制miRNA-200家族的转录来下调其表达,因而在肿瘤的发展中起重要作用[20]。

综上所述,miR-200a在早期卵巢癌中高表达,而在晚期卵巢癌中低表达,提示 miRNA-200a可能作为原癌基因诱导了卵巢癌的发生,并参与卵巢癌的侵袭转移。其可作为卵巢癌早期诊断和判断预后的重要分子标志。但miR-200a在卵巢癌中表达失调的机制目前尚不明确,需进一步实验探讨其相关分子机制。

[1] Fung-Kee-Fung M,Oliver T,Elit L,et al.Optimal chemotherapy treatment for women with recurrent ovarian cancer[J].Curr Oncol,2007,14(5):195.

[2] Bartel D P.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281.

[3] Esquela-Kerscher A,Slack F J.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259.

[4] Shinozaki A,Sakatani T,Ushiku T,et al.Downregulation of microRNA-200 in EBV-associated gastric carcinoma[J].Cancer Res,2010,70(11):4719.

[5] Murakami Y,Yasuda T,Saigo K,et al.Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues[J].Oncogene,2006,25(17):2537.

[6] Braun J,Hoang-Vu C,Dralle H,et al.Downregulation of microRNAs directs the EM T and invasive potential of anaplastic thyroid carcinomas[J].Oncogene,2010,29(29):4237.

[7] Xia H,Ng S S,Jiang S,et al.miR-200a-mediated downregulation of ZEB2 and CTNNB1 differentially inhibits nasopharyngeal carcinoma cell growth,migration and invasion[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,391(1):535.

[8] Liu H,Brannon A R,Reddy A R,et al.Identifying mRNA targets of microRNA dysregulated in cancer:with application to clear cell Renal Cell Carcinoma[J].BMC Syst Biol,2010,4:51.

[9] Iorio M V,Visone R,Di L G,et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer[J].Cancer Res,2007,67(18):8699.

[10] Nam E J,Yoon H,Kim S W,et al.MicroRNA expression profiles in serous ovarian carcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(9):2690.

[11] Dahiya N,Sherman-Baust CA,Wang TL,et al.MicroRNA expression and identification of putative miRNA targetsin ovarian cancer[J].PLOS ONE,2008,3(6):e2436.

[12] Hu X,M acdonald D M,Huettner P C,et al.A miR-200 microRNA cluster as prognostic marker in advanced ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2009,114(3):457.

[13] Fuchs I B,Lichtenegger W,Buehler H,et al.The prognostic significance of epithelial-mesenchymal transition in breast cancer[J].Anticancer Res,2002,22(6A):3415.

[14] Aigner K,Dampier B,Descovich L,et al.The transcription factor ZEB1(deltaEF1)promotes tumour cell dedifferentiation by repressing master regulators of epithelial polarity[J].Oncogene,2007,26(49):6979.

[15] Christoffersen N R,Silahtaroglu A,Orom U A,et al.miR-200b mediates post-transcriptional repression of ZFHX1B[J].RNA,2007,13(8):1172.

[16] Park SM,Gaur AB,Lengyel E,et al.The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2[J].Genes Dev,2008,22(7):894.

[17] Gregory P A,Bert A G,Paterson E L,et al.The miR-200 family andmiR-205 regulate epithelial to mesenchymal transition by targeting ZEB1 and SIP1[J].Nat Cell Biol,2008,10(5):593.

[18] Sivertsen S,Berner A,Michael C W,et al.Cadherin expression in ovarian carcinoma and malignant mesothelioma cell effusions[J].Acta Cy tol,2006,50(6):603.

[19] Landen CN Jr,Birrer M J,Sood A K.Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer[J].J Clin Oncol,2008,26(6):995.

[20] Bracken C P,Gregory P A,Kolesnikoff N,et al.A double-negative feedback loop between ZEB1-SIP1 and the microRNA-200 family regulates epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Res,2008,68(19):7846.