X型胶原在膝骨关节炎软骨中的表达

庞金辉,刘明轩,石文俊,樊海峰,陈贤奇,唐桐生,曹成福

(上海中医药大学附属普陀医院骨科,上海,200062)

膝骨关节炎(OA)因其发病机理尚未完全明确,目前无法有效治愈。研究表明,在OA患者的关节软骨中,软骨细胞和各种细胞外基质均发生显著的改变,由胶原和蛋白聚糖所组成的网络状结构亦出现降解,从而导致了关节软骨的进一步退化。本实验通过对膝OA和正常人关节软骨中X型胶原的检测,分析OA患者X型胶原的表达特征,以探讨X型胶原在膝骨关节炎进展中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 标本情况

收集行人工膝关节置换术患者的软骨标本18例,所有病例均排除继发性OA或类风湿关节炎等其他关节疾病,确诊为原发性OA(诊断标准参考美国风湿病学会1995年版指南),其中女14例,男4例,平均年龄 68.3岁(61～79岁)。正常对照组13例 ,女性9例 ,男性4例 ,平均年龄65.1岁(57～81岁),来源于大腿及以上部位截肢术患者或捐献的新鲜尸体,均无关节疾患。

1.2 实验方法

1.2.1 HE染色:各组标本取下后,去除碎屑,生理盐水冲洗,仔细观察大体情况,取部分做HE染色,其余标本置于-70℃冻存待用。

1.2.2 总RNA抽提:将软骨组织块充分剪碎,PBS洗涤,加入0.2%的Ⅱ型胶原酶/0.1%透明质酸酶的DMEM溶液中,于37℃震荡消化4～6 h,500 g离心获取软骨细胞。取软骨细胞加入Trizol(GIBCO BRL)中,按照实验说明抽提总RNA。余下细胞冷冻备用。

1.2.3 RT-PCR:按照试剂盒说明,将mRNA反转录为 cDNA(2 μ L RNA/20 μ L 体系 ,TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL)。以得到的cDNA为模板进行PCR反应(TaKaRa Taq),以βactin为内标基因。X型胶原的引物序列如下:正义链 5′-TGGGTAGGCCTGTATAAAGAACGG-3′;反 义 链 5′ -CATGGGAGCCACTAGGAATCCTGAGA-3′。X型胶原基因扩增反应条件:94℃变性5 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,反复循环,最后72℃延伸10 min。产物的片段长度为210 bp。

1.2.4 Northern 杂交:取总 RNA 样本 20 μ g左右,在含有2.2 mol/L甲醛的1%琼脂糖凝胶中50 V电泳6 h左右。电泳完毕后,凝胶用DEPC水稍加淋洗,毛细洗脱法将RNA样品转移至尼龙膜,具体步骤按照分子克隆实验指南进行。尼龙膜以0.12 J/cm2紫外线照射交联。取100～200 ng探针片段,以32 P标记,加入到10 mL杂交液(CLONTECH)中,与尼龙膜68℃杂交过夜。次日,将尼龙膜置于 100 mL 1×SSC(20×SSC:3 mol/L NaCl,0.3 mol/L枸橼酸钠)/0.1%SDS中,42℃漂洗20 min;再用100 mL 0.2×SSC/0.1%SDS稍加漂洗。最后,磷屏显影,进行光密度分析。

1.2.5 Western杂交:取预先留存的软骨细胞,加入蛋白裂解液提取细胞蛋白。采用Bio-Rad DC protein assay对总蛋白浓度进行测定后,取30 μ g总蛋白,加入5×上样缓冲液,进行体积分数10%SDS-PAGE电泳,半干转移至硝酸纤维素膜,0.05 kg/L脱脂奶粉封闭过夜后,以1∶2 000比例加入鼠抗人X型胶原抗体,室温作用3 h,Tween20-PBS洗膜5 min×3次,二抗孵育 2 h,同上洗膜3次后,ECL(Amersham)化学增强发光,X线片曝光,显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS 10.0软件进行方差分析和相关性分析,设定P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01差异有显著统计学意义。

2 结 果

2.1 OA软骨的组织学特征

与正常对照关节软骨相比,病变软骨无光泽,呈淡黄色,表面粗糙,有大小不一的软骨碎裂剥脱,软骨下骨暴露,部分有溃疡形成。HE染色显示软骨基质纤维变性,部分细胞增殖活跃,存在簇聚现象。

2.2 RT-PCR检测X型胶原表达

RT-PCR检测X型胶原的结果发现,OA患者的关节软骨细胞中X型胶原在mRNA水平有显著升高。进一步对RT-PCR的结果进行光密度分析,可以发现OA组的collagen-X/β-actin的比值与正常对照的差异有显著性(P<0.05)。

2.3 Northern杂交检测X型胶原表达

Northern检测结果显示,在OA组的关节软骨中X型胶原的表达水平非常显著地高于正常对照组(P<0.01),OA组平均水平达到对照组的2.40倍。

2.4 Western杂交检测X型胶原含量

在蛋白水平,Western杂交检测结果提示,OA患者的关节软骨基质中X型胶原的含量,与正常对照组相比显著升高(P<0.01),有显著的统计学差异。

2.5 X型胶原mRNA和蛋白表达变化的相关性分析

将各例OA患者的RT-PCR、Northern杂交与Western杂交结果,通过Pearson相关性分析,最终显示mRNA与蛋白水平的X型胶原的表达水平的变动并不具有显著的相关性(P>0.05)。

3 讨 论

在正常关节的透明软骨中,由Ⅱ、Ⅸ和Ⅺ型各种不同的胶原纤维交联成的网络结构提供其必要的组织强度和顺应力[1]。X型胶原是一种短链的非纤维性胶原,由三条相同的α 1链组成三聚体,正常存在于软骨化骨中心及骨骺软骨生长板内的软骨细胞周围的基质中。X型胶原可以形成栅格状的结构,并与Ⅱ型胶原纤维发生联系,影响关节软骨的结构和强度[2]。

骨关节炎是老年人最常见的慢性关节疾病,其发病过程中最主要的特点是关节软骨的进行性丢失[3]。在OA患者的关节软骨中,软骨细胞自身的生长和增殖,及其基质的合成和代谢均出现紊乱[4]。根据本实验的结果,无论是在mRNA水平还是在蛋白水平,OA患者的关节软骨中X型胶原的表达都要显著的高于正常对照组。在OA患者的关节腔中,由于炎症反应的进行,存在各种细胞因子,如IL-1β和 TNF-α等[5-7]。分解性细胞因子和合成性细胞因子之间的平衡维持着软骨基质合成代谢和分解代谢的平衡,二者比例的失衡是OA软骨基质的降解和破坏的重要原因[8-9]。当周围的生化条件发生改变,OA的关节软骨中,软骨细胞会失去正常表型,转化成肥大软骨细胞,不再表达Ⅱ型胶原,转而大量合成X型胶原。在很多的临床病例中,都发现OA的发生往往伴随着X型胶原的合成和沉积,并且随OA的病变过程,X型胶原的阳性表达会扩展向软骨表面的纤维化区和骨赘形成的区域[10]。

经本实验的统计学分析,我们又发现在膝OA的关节软骨中,X型胶原在mRNA和蛋白水平表达的变化情况并没有显著的相关性。这种不一致性,我们认为主要是因为OA关节软骨中细胞凋亡与基质降解的不同步性造成的。当细胞发生凋亡时,既没有mRNA的合成,又在酶的催化作用下使原有的mRNA等生物大分子迅速降解。但与此同时,细胞外的X型胶原蛋白并不会像mRNA那样急速的分解,因而,在各个具体的OA关节软骨中,X型胶原的mRNA和蛋白水平表达的状况并不是同步的。

本实验的Northern杂交与RT-PCR结果的差别提示我们,Northern杂交是一种更为精确和可信的半定量检测方法。由于RT-PCR历经了2步酶反应,其间的平台效应可能会影响到实验结果的准确性[11]。

在临床中,OA一般常见于老年人群,是一种较为普遍的老年性疾病。在老化过程中,软骨细胞合成Ⅱ型胶原和X型胶原的能力逐渐变化,令基质中Ⅱ型/X型胶原的比例不断降低。当膝OA发生后,半月板显示有相当程度的崩解与中心的骨化,四周的软骨基质强烈表达X型胶原,且由于结构松散易被水解。而软骨中的胶原代谢率极低[12],当外周的基质被水解后,软骨细胞直接与炎症反应中的各种细胞因子接触,大量凋亡,更加无法补偿被破坏的胞外基质,从而使OA的病症进一步恶化。

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