RNA干扰及其在肝癌治疗中的研究进展*

陈启斌 荚卫东

自1998年由Fire等[1]首次发现基因沉默现象以来，RNA干扰技术发展迅速，RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，是多因素、多阶段、多基因相互作用的结果，包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因的激活和抑癌基因的失活、细胞的凋亡和增殖调节失控、修复基因结构和功能缺陷等[2]。在其癌变、增殖、转移、复发等一系列过程中伴随着不同阶段的癌基因或抑癌基因变异，引起相关因子表达的紊乱。针对这些生物学特性，已经有许多RNA干扰技术应用于肝癌的基因治疗与研究。RNAi因其特有的高效性、特异性、低毒性，为肝癌基因治疗的研究开辟了一条新的途径。

一、RNAi概述

（一）RNAi的发现 1995年Guo等[3]人在阻断秀丽新小杆线虫中par-1基因表达的研究中发现，对照实验组注射正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA同样的结果，即特异性阻断该基因的表达。1998年，由Fire等[1]证实，正义RNA抑制基因表达的现象是由于体外转录的RNA中污染了少量dsRNA而引起的，并发现纯化后的dsRNA具有比正义链或反义链更强的基因沉默效应，故将dsRNA能导致转录后基因沉默的这一现象首次称为RNAi现象。随后在一些植物和低等无脊椎动物中陆续发现RNAi效应存在[4]。早期研究者采用较长序列的dsRNA总是导致基因的非特异性抑制，以致认为在哺乳动物细胞中是不能以RNAi技术诱导特异性基因抑制的[5]。2001年，Elbashir等[6]将人工合成的19-21nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）通过阳离子脂质体转入人胚肾细胞和Hela细胞，成功地在哺乳动物细胞产生了特异性的基因沉默，解决了长片段dsRNA在哺乳动物细胞内引起非特异性干扰的问题，从此RNAi技术得以广泛应用于哺乳动物和人类细胞的研究。

（二）RNAi的机制与应用 在RNAi过程中，dsRNA被特异性核酸内切酶（dsRNA specific endonuelease，Dicer）切割成约21-23nt的短双链片段[7]，即siRNA。siRNA双链3’端为羟基末端，且有两个不配对的碱基，此结构可能对siRNA形成蛋白复合体是必须的，两端的5’-磷酸盐是真正的siRNA和细胞其他dsRNA赖以区分的结构基础。另外，siRNA的5’—磷酸盐可能充当靶RNA裂解位点的一种分子参照[8]。由siRNA中的反义序列指导形成一种蛋白复合体，该蛋白复合体被称为RNA诱导的基因沉默复合物（RNA induced silencing conplex，RISC）。siRNA作为引导序列引导RISC与同源性的mRNA结合，解旋酶催化mRNA与siRNA的正义RNA链相互交换，反义RNA链与同源mRNA结合后，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5’起始端下游7-10个核苷酸处（也就是双链区的靠近中间位置）切断mRNA，导致其降解，阻断相应基因的表达[9]。降解的mRNA被释放后，siRNA双链重新形成，可以继续降解同源mRNA[10]。siRNA也可作为一种特殊引物，在RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA[11]，后者再次被Dicer切割成siRNA，新生成的siRNA又可进入上述循环，这一过程称为RNAi的放大效应。新生成的dsRNA被反复合成与降解，不断产生大量新的siRNA，从而使靶mRNA渐进性减少，有效抑制靶向基因蛋白质或多肽合成，呈现基因沉默现象[12]。此外，siRNA本身也可在RdRp作用下进行自我复制，使信号不断扩大，产生扩增效应，不断引起相应的mRNA降解。RNAi技术作为一种简便而又高效特异的抑制靶基因表达的新技术，已被广泛应用于基因功能研究、抗病毒和抗肿瘤基因治疗以及药物开发等领域的探索之中[13]。

二、RNAi在肝癌治疗研究中的应用

（一）肝癌基因RNAi治疗靶基因的选择 通过RNAi技术作用于肝癌的发生、发展的各相关因素和多个阶段中有重要作用的靶基因，调节基因间的相互作用是目前RNAi用于肝癌研究的主要方向。

RNAi在肝癌研究领域中可体现在以下几个方面:（1）RNAi可应用于敲除点基因突变激活的癌基因。基于高度特异性，尽管突变基因和野生型基因通常只有一个不同的碱基，RNAi仍可对突变基因产生抑制作用，而对正常细胞中的野生型基因不产生抑制作用[14]；（2）RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达；（3）RNAi可应用于抑制基因扩增。基因扩增是指原癌基因通过某种机制在原染色体上复制出多个拷贝数，导致表达产物异常增多，细胞增殖。设计基因扩增中起重要作用的基因siRNA或shRNA[即短发夹RNA，包含两个短反向重复序列（其中一个与目的基因互补），中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工成siRNA，降解目的基因，可抑制目的基因表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖[15]；（4）RNAi可应用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因的表达，如肿瘤多耐药基因；（5）RNAi可针对血管生成因子及其受体；（6）等位基因特异性抑制（ASI），ASI是一针对肿瘤细胞中与缺陷基因对应的正常等位基因进行治疗的方法，其前提是该等位基因属杂合子并且是细胞生命活动所必需的。抑制了正常等位基因的肿瘤细胞会死亡，而正常细胞由于等位基因的代偿而不受影响。

Yin等[16]采用脂质体法将单一或组合的siRNA转染肝癌细胞、HeLa细胞、肺腺癌细胞、卵巢癌细胞和黑色素瘤细胞。结果显示，siRNA不仅特异性清除了靶目标如bcl-2、cdk-2、mdm-2、pkc-alpha、tgf-betal、H-ras、vegf和 GFP 的 mRNA，而且不同程度上抑制了癌细胞的增殖，从而证实这些人类肿瘤细胞内都存在RNAi机制，他们认为载体携带、化学合成的siRNA通过细胞内RNAi体系使靶mRNA沉默，组合不同的siRNA可抑制癌细胞的增殖和生长。Li等[17]在研究IFN-gamma/LIGHT介导细胞凋亡信号通路机制的同时，通过RNAi手段阻断Hep3B细胞中Bcl-XL的过表达，发现在Hep3B细胞中Bcl-XL的过表达能增强对IFN-gamma/LIGHT介导凋亡的抵抗。Wu等[18]以人工合成的miRNAs介导的RNAi技术下调CC趋化因子受体（CCR）1基因在肝癌细胞系HCCLM3中的表达，可抑制HCCLM3细胞的侵袭能力，CCR1基因表达下降可显著减少基质金属蛋白酶（MMP）-2的分泌，后者与肿瘤转移密切相关。

肿瘤细胞增殖所需的能量，核酸合成所需的核苷酸均由磷酸戊糖途径直接或间接产生，转酮醇酶就是这一途径的限速酶，原癌基因转酮醇1（transketolase-like protein 1，TKTL1）是转酮醇酶家族中的一员，其所定位的区域包含了许多与肿瘤恶性转化和细胞周期有关的基因，在肿瘤发生发展上起到十分重要的作用[19]。Zhang等[20]通过RNAi技术在肝癌细胞中抑制TKTL1的表达，发现能明显影响肝癌细胞的增殖、侵袭活力，可望成为肝癌治疗的新靶点。Sun等[21]通过RNAi抑制了人肝癌细胞系Bel-7402细胞系上皮-间质细胞转变因子（Twist1）基因的表达，发现肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显下降。Salvi等[22]通过RNAi抑制了肝细胞生长因子受体（c-Met）的表达，进而抑制了肝癌SKHep1C3细胞的转移。陆彬彬等[23]以血管内皮生长因子（VEGF）shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721，可阻断大部分肝癌细胞VEGF蛋白的表达，细胞增殖能力降低，单个细胞克隆形成能力明显下降。VEGF被公认与肝癌转移密切相关，因此认为，VEGFshRNA真核表达载体可应用于肝癌的基因治疗。

（二）肝癌基因RNAi治疗干扰方式的选择

（1）化学合成的RNAi：对于瞬时基因沉默实验，化学合成的、非载体的方法比载体法有着明显的优势：化学合成的siRNA设计简易；操作简便；对细胞或组织的毒副作用较小；容易获得高水平的瞬时沉默效果；特异性强；同样的实验条件下，在不同实验室重复性高。但其稳定性较差，作用时间较短。朱晓群等[24]通过化学合成骨桥蛋白特异性siRNA干扰高转移肝癌细胞株HCC-LM3，可显著降低骨桥蛋白的表达，且抑制了肝癌细胞的侵袭转移能力。陈钟等[25]化学合成了PLK1基因的siRNA，转染人肝癌HepG2细胞后，可明显抑制肝癌细胞增殖，诱导凋亡。

（2）载体介导的RNAi：基于DNA载体的siRNA可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，其特点有：产生shRNA来完成RNA干扰；方法简单、经济实惠，只需合成DNA寡核苷酸；克隆载体使用方便，带有筛选标记，可帮助建立稳定转染细胞系；shRNA质粒稳定，易于操作。檀英霞等[26]将肝素酶短发夹式RNA（Hpa-shRNA）真核表达载体稳定转染人肝癌细胞株HepG2（高表达Hpa）后，明显抑制了肝素酶（Hpa）的表达，且接种于裸鼠皮下，可抑制体内肿瘤的生长。赵岳等[27]建立靶向N-ras基因的shRNA表达载体，转染肝癌细胞后，可明显抑制N-ras基因的表达，且诱导细胞凋亡。Luo等[28]通过载体介导的shRNA干扰肝癌细胞中极低密度脂蛋白受体II（VLDLRII）的表达，使得肝癌细胞处于G0/G1期，抑制了细胞增殖。

（3）慢病毒介导的RNAi：慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点作为一种重要的基因转移工具被应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域，区别一般的逆转录病毒载体，他对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。Huang等[29]通过慢病毒介导的RNAi技术沉默Smad4基因表达，干扰了转化生长因子β-Smad4信号传导途径，从而抑制肝癌细胞增殖，诱导凋亡。李俊等[30]采用慢病毒介导的RNAi技术干扰人IKKα、IKKβ基因的表达，并且观察其对肝癌细胞生长的影响，发现IKKα、IKKβ基因的表达被沉默后，肝癌细胞的生长明显受到抑制。

三、展望

原发性肝癌是我国发病率和复发率较高的恶性肿瘤之一，肝癌术后的高复发、转移率是目前肝癌治疗的巨大挑战。因此，研究肝癌复发转移的分子机制，对于寻找有效治疗方法具有重要的意义。RNAi为肝癌研究开辟了新途径，其应用于肝癌的治疗正成为肝癌基因治疗研究的新热点。

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