耐阿德福韦酯乙型肝炎病毒感染与处理研究进展*

方立庆 综述 张振华 李旭 审校

HBV感染严重危及人类的健康。据统计全球范围内大约有3.5亿HBV慢性感染者[1]，其预后不良，易反复发作，可发展为肝硬化和原发性肝癌。核苷（酸）类药物问世已有11年，在这段时间内，大大提升了对慢性乙型肝炎（CHB）患者的临床管理。但抗HBV药物的耐药已成为制约乙肝抗病毒治疗的最重要问题之一。阿德福韦酯（ADV）是嘌呤类核苷类似物，2002年获得美国食品药品管理局（FDA）批准上市，2005年国家食品药品监督管理局（SFDA）批准在我国应用于临床。ADV能有效抑制病毒的复制，但随着时间的延长，对其耐药的变异株被选择出来，且渐成为优势毒株。本文就ADV抗HBV治疗的耐药现状及耐药突变的基础、ADV耐药的检测及预防方法、ADV耐药后的挽救治疗策略等方面做简要综述。

一、ADV抗HBV的耐药现状及其耐药突变的基础

（一）耐药现状 ADV耐药率较低，ADV治疗1～5年的累积耐药相关变异发生率分别为0%、3%、11%、18%、29%，因耐药出现病毒学与生化学突破的概率在1～5年时分别为0%、2%、6%、10%、11%、l2%[2]。长期使用ADV的患者可发生rtA181V/T和（或）rtN236T变异，导致对ADV耐药[3]。这是目前已证实的与阿德福韦耐药相关的主要变异。其他变异还有 rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S等。原发性 ADV耐药（rtA181T、rtI233V）也有报道[4]。Schildgen等[5]报道了3例慢性乙型肝炎患者出现罕见的HBV聚合酶RT区变异rtI233V。对拉米夫定（LAM）耐药患者，加用或换用ADV，出现ADV耐药的发生率显著高于ADV初治患者[6]。ADV治疗包括LAM耐药病例在内的CHB患者，1年耐药发生率升高至5%，2年发生率为20%[7]。

邵幼林[8]等对28例初始LAM治疗的CHB患者，其中男25 例，女 3 例，年龄 18～60（平均 36.67±10.54）岁，出现 LAM耐药后换用ADV单药序贯治疗，发生ADV再耐药患者HBV变异株动态变化存在5种形式：（1）随HBV DNA逐渐下降，LAM耐药株比例减少并发生完全病毒学应答：随疗程的延长，HBV DNA突破，ADV耐药变异出现（8例）；（2）换用ADV治疗后不充分病毒学应答，在LAM耐药株的基础上出现ADV耐药变异，即对LAM和ADV的多重耐药变异株（3例）；（3）换用ADV治疗后不充分病毒学应答，LAM耐药株依然存在（10例）；（4）换用ADV治疗后不充分病毒学应答，LAM耐药株消失后成为野毒株（4例）；（5）LAM和ADV治疗过程中病毒学均不充分应答，但无耐药变异（3例）。

（二）耐药产生基础 HBV聚合酶缺乏3’-5’外切酶校对功能，错配发生率较高，因此HBV比其他DNA病毒更容易发生变异。在HBV慢性感染者体内存在不同准种（quasi-specie）[9]，一个准种即一个突变株，所以HBV在复制过程中具有较高的自然变异率，并且每24h就可产生3.2×1010含有单一位点突变的HBV DNA[10]。如果HBV基因突变恰好位于HBV DNA聚合酶（P）的逆转录酶区域，就有可能产生耐药。

另外，HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV持续感染的关键[11]。cccDNA不仅是转录各种病毒RNA模板，同时也是HBV病毒前基因组RNA的复制模板，编码多功能聚合酶、核心蛋白质及X和S蛋白[12]。目前尚无特效药物作用于cccDNA，且一些变异株也可能以cccDNA形式存在，这使得耐药菌株可持续存在。所以，HBV DNA的复制率高、突变率高和cccDNA难以清除是HBV容易出现耐药的主要因素。

由于HBV本身的复制特点，对抗病毒药物耐药是不可避免的。与耐药有关的因素除了上述的病毒因素外还主要包括宿主因素和药物因素。宿主因素：治疗前患者的HBV DNA水平、抗病毒治疗不规则以及抗病毒药物选择不合理、患者的依从性差等。药物因素：药物的空间结构、基因屏障和药代动力学屏障等。ADV与自然底物脱氧胞苷三磷酸（dCTP）存在微小差异，而LAM与dCTP存在显著差异因此ADV耐药发生率明显低于LAM。

ADV和HBV野生型毒株作用时，与HBV-RT区有两个氢键紧密结合：一个位于RT区236位天冬氨酸的末端氢原子和ADV的末端磷酸根的氧原子之间，另外一个位于236位天冬氨酸的羰基和85位丝氨酸的羟基之间。当发生rtN236T变异时，这两个氢键会丢失，同时伴随着静电相互作用的显著减少，而此时脱氧三磷酸腺苷（dNTP）与DNA聚合酶的亲和力下降却不明显，HBV DNA仍可继续大量合成[13]。

目前耐药病毒因素的研究已取得一定的成效，宿主因素、基因屏障和药代动力学屏障目前研究处于初级阶段，HBV对阿德福韦耐药的分子基础研究甚少，均有待进一步研究深入。

二、ADV耐药的检测及预防方法

（一）ADV耐药的检测方法尽管有多种方法[14]（限制性片段长度多态性分析法、DNA芯片法、焦磷酸测序法、克隆测序法、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱测定法等）可以用来监测ADV耐药突变，但临床上应用最多的还是PCR产物直接测序法（direct or population sequencing）和反向线性杂交法（INNO LiPA）[15]。PCR产物直接测序法提供的信息量丰富，可检测已知与未知的突变，缺点是检测灵敏度较低，常需要血清HBV DNA＞104copies/ml，病毒突变株的比例达20%～25%。INNO LiPA的检测灵敏度高，最低能够检测到5%的突变株，但只能检测到已知的突变，且现阶段分辨同一突变位点（如rt184位点）多种突变形式的能力有限[16]。总之，设计灵敏、简便、经济的耐药检测方法是今后HBV耐药检测的一个重要课题。

（二）ADV耐药的预防方法 有研究证实ADV治疗LAM耐药患者时ADV的耐药发生率要比ADV治疗初治患者时高，且疗程不足会导致肝炎复发。Ayoub WS等[17]指出需要长期治疗的患者单用或联合治疗核苷（酸）类药物都能有效地防止耐药性的发生发展。单用治疗：有学者认为LAM耐药的产生让患者在后续抗病毒治疗中面临更大的耐药风险，因此在核苷初治患者启动抗病毒治疗时，可以选择耐药基因屏障较高（同时发生3个或3个以上位点变异才导致耐药）、抗病毒效应较强的药物，如恩替卡韦或替诺福韦来预防耐药的产生[18]。联合治疗：最近Lampertieo P等[19]应用ADV联合LAM治疗145例LAM耐药的CHB患者3年，其中有116例（约80%）出现HBV DNA清除，145例均无临床学和病毒学的突破。无论HBV DNA的抑制程度如何，rtA181v/T是惟一检出的与ADV耐药相关的变异，在基线时6例（1 rtA181V和5 rtA181T），治疗期间增加3例（为rtA181T）。此9例患者中7例在治疗期间HBV DNA下降不明显。rtA181T变异4年累计发生率为4%。由此可知ADV与LAM联合治疗可降低HBV对ADV耐药性。国内周淑云等[20]观察152例ADV治疗LAM耐药CHB患者疗效以及ADV的耐药情况，也证明了此项结果。

此外，选择合适的时机进行抗病毒治疗、提高患者依从性、早期应答不理想及时换药等也有助于预防耐药的发生。ADV可在治疗48周时进行疗效评估。如果患者血清HBV DNA未达到检测值下限，则在此时调整治疗方案以降低后期耐药的发生率。

三、ADV耐药后的挽救治疗策略

（一）药物替代疗法 在ADV发生耐药后，可选择和ADV耐药位点不重叠而且无交叉耐药的药物治疗。出现rtN236T耐药可选择拉米夫定（LAM）、恩替卡韦（ETV）或替比夫定，而对rtA181V突变的菌株LAM、ETV的敏感性有所下降，对替诺福韦敏感性较高。替诺福韦对ADV耐药者有较好疗效，无论是发生rtA181 V、rtN236T单一突变还是联合突变，均对替诺福韦敏感[21]。Laoi BN等[22]使用恩替卡韦成功治疗了2例ADV耐药（分别是rtAl81V和rtAl81T变异）的患者。Schildgen O等[23]使用替诺福韦治疗对ADV原发性耐药（rtI233V）的3例患者，均取得满意的效果。

（二）联合用药 ADV耐药后联合用药的临床资料报告鲜见。目前推荐，对于发生ADV耐药的患者，在临床上可加用LAM，可能优于换成LAM单药治疗。各种抗HBV核苷类似药物陆续出现，在一定意义上为联合治疗提供了条件。联合治疗能够增强抗病毒能力和减低耐药的发生率。对于LAM耐药的患者采用LAM+ADV联合治疗，产生ADV耐药的概率小于单独用ADV[24]。但在抗HBV联合用药治疗的研究方面还不够充分[7]。有研究指出，干扰素联合ADV使用既克服了单用干扰素对高载量病毒、高ALT水平疗效欠佳的缺点，同时也避免了单用ADV容易耐药及不能够突然停药的特点[25]。也有ADV联合胸腺肽以及具有免疫调节作用的中药（甘草酸二胺肠溶液、苦参素等）治疗相关报道。联合治疗可能是未来抗病毒研究的新热点。

（三）免疫调节治疗 HBV感染后可引起人体对HBV的免疫耐受（产生无或低免疫应答），体内的HBV不能清除，使得病毒在体内的持续存在和复制。免疫调节治疗的目的就是打破免疫耐受，恢复病毒特异性T细胞的应答。目前CHB免疫治疗多为非特异性免疫调节剂，包括胸腺肽、胸腺肽a1、微卡（母牛分枝杆菌制剂）、左旋咪唑搽剂等。特异性免疫调节剂包括各种治疗性疫苗，如特异性细胞毒性T淋巴细胞多肽疫苗、S和前S2蛋白疫苗、HBsAg/抗-HBs免疫复合物疫苗、HBV特异性核酸疫苗等[26]。免疫调节治疗相关的研究还不够充分，临床尚未有统一意见，能否成为抗HBV治疗的主力还有待研究。

四、小结

长期抗病毒治疗导致耐药菌株不断出现，是目前抗病毒治疗的一大难题。必须高度重视预防HBV多重耐药毒株的出现，应尽快建立研究HBV耐药的一系列技术平台。耐药的检测、预防显得尤为重要，但目前还不能确定哪一种方法是检测的“金标准”，将来需要进行更多的试验研究。另外，基因表型分析能帮助临床工作者选择最优的治疗方案，有利于预防和减少耐药率。联合治疗可能是将来治疗慢性乙型肝炎的重要趋势。目前，对联合治疗的评估研究仍处于初级阶段，新的、更安全的、更有效的联合治疗方案还有待进一步临床和实验研究。

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