脑损伤细胞供体的研究现状

周虎传 张玉波 田洪 宋川 刘磊

脑损伤所引起的神经功能损伤严重影响患者的生活质量，并给社会和家庭带来沉重的经济负担，因此寻找损伤后神经功能修复的方法已成为目前研究的热点，而细胞移植是修复神经损伤的方法之一。而参与移植的细胞种类繁多，为了寻找一种更好、更合适的移植细胞，本文就目前出现的各种移植细胞做一综述。

1 神经干细胞

神经干细胞(NSC)是神经系统中终生保持增殖和分化潜能的细胞，处于分化的终末状态，可通过对称或不对称分裂，生成新的干细胞和分化潜能逐渐降低的子细胞，最终生成中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。NSC主要存在于胚胎时期的脑室和脑室下区的组织中，也存在于成人的临近脑室室管膜下区、侧脑室的室管膜、海马齿状回的颗粒细胞下层、脊髓中央管膜［1］。神经细胞损伤后，体内的室管膜神经干细胞被激活并增殖、迁移到损伤部位，损伤后1个月内可新增200万个细胞，然而这些新增细胞大部分是胶质细胞，主要促进损伤部位胶质瘢痕形成，在促进神经功能恢复是有限的，因此仅依靠内源性的神经再生不能达到完全修复神经细胞损伤的目的。因此将异体NSC移植入脑损伤患者体内促进脑损伤患者功能恢复成为必要。NSC是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，不被免疫系统识别，可以与宿主的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活。神经干细胞在体外也能有效增殖［2］。因此异体神经干细胞作为脑细胞移植细胞是可行的。许多研究表明，NSC移植物在宿主中枢神经系统(CNS)内具有明显的生存、迁移和分化能力，由人胎脑分离的NSC在植入胚胎或新生鼠脑内后，表现为在宿主脑内迁移并进行区域特异性分化，若将人胎脑NSC植入成年大鼠室管膜下区，它们沿吻侧迁移流迁移入嗅球，分化为双极神经元，其分化命运与存留于室管膜下区的内源性NSC相同。从成年哺乳动物CNS分离的NSC也具有较强的分化潜能，而决定NSC分化命运的主要因素除局部微环境外，还包括NSC的内在特性。如成年动物脊髓NSC植入海马齿状回，能分化为神经元;若植入成年大鼠脊髓则不分化为神经元。将从成年动物海马齿状回获得的NSC植入成年大鼠室管膜下区或迁移流后，能分化为嗅球神经元;若植入成年大鼠海马，则产生新的海马神经元［3］。无论胚胎或成人NSC，在移植入成人CNS非神经发生区后大部分都分化成神经胶质细胞。

目前NSC的应用还存在不少问题:如建立的NSC系绝大多数来源于鼠，而鼠与人之间存在明显的种属差异;神经干细胞的来源不足;部分移植的NSC发展成脑瘤;NSC转染范围的非选择性表达及转染基因表达的原位调节;利用胚胎干细胞代替神经干细胞存在着社会学及伦理学方面的问题等。NSC的来源、分离、培养及鉴定还有许多工作要做，神经干细胞诱导、分化及迁移机制有待进一步研究。通过细胞培养技术及基因组的研究，如DNA微列阵技术，进一步明确成体神经干细胞的确切位置，可以设计药物特异性地激活这些细胞。进一步认识NSC的本质和控制分化基因，通过调控靶基因，可以从NSC诱导产生特定的分化细胞来满足各种需要。横向分化的发现对NSC的研究和应用具有重要意义，人们有望从自体中分离诱导出神经干细胞，有可能解决NSC的来源问题，NSC的应用将有广阔的前景。

2 间质干细胞

间质干细胞是中胚叶来源细胞，已经从骨髓、脂肪组织、脐带血、胎盘、胰腺分离出来。间质干细胞具有强大的免疫调节效应，能有效抑制T细胞、B细胞、NK细胞的增生和功能，从而减少了免疫排斥反应，增加间质干细胞受体的耐受。一旦间质干细胞能从捐献者身上分离、扩增并冷藏保存，这种免疫抑制特点使间质干细胞成为异体细胞移植的一个重要选者类型。有研究报道骨髓来源的间质干细胞能产生神经元细胞和许多组织特异细胞表型。有研究报道证实向新生鼠大脑侧脑室移植入间质干细胞，间质干细胞可移行并分化为嗅球颗粒细胞和室周星形细胞［4］;有研究报道证实移植入大鼠体内的间质干细胞可移行到损伤的脑组织并存活下来，有部分植入的间质干细胞表达神经元和星形细胞的标志，间质干细胞治疗显著提高了脑损伤后神经功能恢复;研究证实在大鼠大脑损伤后6 h内尽早向鞘内注入1百万个间质干细胞，注入的间质干细胞可提供神经保护;在脑外伤、中风后24 h内或1周内注入间质干细胞2～8百万个也显著提高神经功能恢复结果;在卒中后1个月注入间质干细胞3百万个证实具有治疗学意义。间质干细胞表达趋化因子受体4(CXCR4)、SDF1与趋化因子4(CXCR4)相互作用，可能促使植入的间质干细胞移向损伤脑组织［5］。间质干细胞分泌各种各样的生长因子包括脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子(FGF)，因而可扩大内生脑组织水平。间质干细胞也能诱导内源性实质细胞产生这些生长因子，这些营养因子能增强脑损伤边缘区的血管再生和血管稳定，而脑损伤边缘区是在脑内存活下来的大多数间质干细胞定植的地方。间质干细胞能增加VEGF的表达促进卒中后血管再生，这些生长因子也能促进神经再生。间质干细胞不仅能增加脑损伤后边缘带和海马的血管密度，而且能增加大鼠脑损伤后的海马亚粒状区和侧脑室下区的神经再生。另外，间质干细胞可诱导损伤脑组织星形细胞中骨形态发生蛋白BMP2、BMP4、连接蛋白的表达，并能促进突触发生，在卒中大鼠，间质干细胞不仅与增强血管再生、神经再生、突触发生一致，间质干细胞能显著减少胶质瘢痕形成并能促进神经胶质轴突重塑［6］，因此间质干细胞发挥的治疗作用可能不仅归因于少量的分化为脑细胞的间质干细胞，然而间质干细胞似乎作为营养因子的产生细胞通过血管再生、神经再生、突触再生和轴突重塑促进了脑功能恢复。如果脑损伤大鼠延迟治疗，仅靠间质干细胞的单独作用，不能减少脑外伤后的脑损伤体积，而随间质干细胞一起植入的胶原支架确能减少脑损伤体积，促进间质干细胞移行入损伤边缘带，并且改善立体空间学习和感觉运动功能［7］。

3 脐带血来源的干细胞

脐带血来源细胞因为具有易于收集、较大的可用性、相对较低的免疫原性可以减少排斥反应、可以静脉注射植入等特点，因此可能成为细胞移植的备选细胞。脐带血来源干细胞能分化为造血干细胞和非造血干细胞，脐带血来源干细胞由未成熟的淋巴细胞和单核细胞组成，大约有1%的单核细胞是CD+34细胞，CD34是造血干细胞和内皮祖细胞的标志物［8］。脐带血来源干细胞的不成熟性增加了其转分化为其他细胞类型用于自体和异体移植的可能性。另外，脐带血来源干细胞产生间充质细胞，间充质细胞在体外能大量增殖，因不能分化为脂细胞，所以分化谱系有限。内皮祖细胞能分泌血管生长因子和促进神经再生，已经从脐带血来源CD+34细胞分离出来，在体外可促进胚胎干细胞生长。脐带血细胞被建议用于神经性障碍的治疗，因为脐带血细胞能分化为胶质细胞和神经元样细胞［9］。

4 造血干细胞

造血干细胞存在于循环末梢血和骨髓中。它们分化为其他细胞类型的潜能还没有被证实，但是研究表明造血干细胞自体移植能调节因自体免疫复合物导致的神经变性疾病的早期免疫应答［10］。

5 脂肪来源基质细胞衍生干细胞

ADSCs是间充质细胞的一个备选来源，能分化为脂肪细胞、骨细胞、肌肉。这些多能干细胞易于培养扩增，适用于自体干细胞移植。然而几乎没有研究证实这些细胞可以分化非中胚层组织细胞系，如神经元。而且也没有显示出这些细胞在神经变性疾病动物模型上有治疗意义［11］。

6 子宫内膜再生细胞

子宫内膜再生细胞是间充质样细胞，能分化各种中胚层、外胚层和内胚层组织。子宫内膜再生细胞不表达间充质细胞标志物STRO-1，但是可以表达非造血干细胞表型和胚胎干细胞标志物oct-4细胞扩增证实子宫内膜再生细胞没有至肿瘤性、没有致畸染色体核型和功能。初步研究证实子宫内膜再生细胞具有免疫调节特性，这对异体移植是需要的。子宫内膜再生细胞是一种引人注目的新的干细胞备选细胞;因为可以无创的从月经血里收集这种细胞，并且具有强大的增生能力，已经证实对四肢缺血和坏死模型具有治疗效果［12］。

7 胚胎干细胞

胚胎干细胞(ESCs，简称ES或EK细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。研究者在1995年从猕猴分离出第一个胚胎干细胞，几年后又从绒猴和人类分离出胚胎干细胞［13］。人体胚胎干细胞系的开发代表胚胎干细胞为发育生物学、药物发现、移植、再生医学的研究提供了无限的细胞来源。但是在它们的潜能被利用之前，需要做更多的鉴定和评估来克服它们在应用中的遗传问题:如缺乏遗传稳定性，致畸胎瘤的风险、缺乏长期生存的能力。

8 来源于孤雌生殖、体细胞核移植和改变的体细胞核移植的ES样细胞

因为用胚胎干细胞进行研究有许多限制因素，所以研究者找到了一种与ES具有相似特点的细胞，主要通过孤雌生殖、体细胞核转移和改变的体细胞核转移获得这种细胞，这种方法避开了为了获得ES而致胚芽死亡的伦理问题。孤雌生殖是一种无性繁殖，胚芽的形成不需要雄性受精;缺乏雄性的DNA意味着孤雌生殖不会充分发育，但是能提供囊胚，产生能分化为各种需要的细胞类型的ES。哺乳类动物卵母细胞在体外激活后其孤雌激活胚可以发育到囊胚期，在鼠和非人灵长类如猴子中已建立了孤雌胚胎干细胞系，具有ES相似的多潜能性。人类卵母细胞可在体外激活后成功获得孤雌激活胚，并在体外培养可发育至囊胚。研究发现孤雌ES系经体外培养诱导，可以分化成多巴胺能神经元细胞、自发跳动的心机样细胞、脂肪细胞、上皮细胞。在患有严重免疫缺陷病的小鼠腹腔培养，该细胞系发育成完全分化的软骨组织、肌肉和骨骼、神经元、黑素细胞、皮肤和毛囊、肠道和呼吸道上皮组织。体细胞核移植又称体细胞克隆，作为动物细胞工程技术的常用技术手段，即把体细胞核移入去核卵母细胞中，使其重组并能发育为新的胚胎。虽然至少有一项研究报道通过体细胞核移植成功获得ES样细胞，但是这种方法成功率很低，仍然存在伦理方面的问题，因为这种方法仍然会产生一个能充分发育并且能植入的胚芽。改变的体细胞核移植是一种更容易被接受的克隆变体。在体细胞核移入去核卵母细胞之前，体细胞核内用于胚胎形成必不可少的基因被彻底改变了，从而不能发育成胚胎，但是能获得ES样细胞［14］。

9 诱导性多能干细胞

诱导性多能干细胞来源于皮肤成纤维细胞，成纤维细胞通过一组组合基因的激活使其脱分化为多能干细胞。这种技术绕开了破坏胚芽、克隆技术、卵母细胞的利用率等存在伦理问题。研究者已经成功的从齿嗤类、猕猴、人类获得了诱导性多能干细胞，他们已经从肌萎缩侧索硬化、脊髓性肌萎缩、帕金森患者的成纤维细胞获得诱导性多能干细胞。从患病供体获得诱导性多能干细胞可能推进个体化用药和体外疾病模型的发展。此外，诱导性多能干细胞移植可以让受体与供体得到完美的免疫匹配，虽然这种移植的临床可行性还需要解决与移植物存活、长期分化、遗传稳定性相关的主要问题。已有研究证实结合维甲酸诱导和无血清培养基筛选方法，可以高效率诱导人诱导性多能干细胞向神经干细胞转化［15］。

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