均匀设计优化京万红超临界萃取工艺研究

艾庆波，赵　宇，国大亮*，黄秋霞，潘　超，刘玉璇

(1.天津中医药大学，天津 300071；2.天津达仁堂京万红药业有限公司，天津 300000)

京万红是家喻户晓的外用复方中药油膏制剂，广泛用于烧伤、疮疡、刀伤、外伤和创面溃疡等症的治疗[1]。京万红的原提取工艺为高温油浸，其热敏有效成分易损失。超临界萃取技术多用于单味药材的提取，本研究首次将超临界萃取技术用于京万红大复方，低温提取京万红处方中的中低极性成分，以均匀设计优化萃取工艺参数，为京万红的现代中成药二次开发提供试验基础[2-3]。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

紫草、白芷、地榆、地黄、当归等26种饮片均由天津市达仁堂京万红药业有限公司提供；色谱乙腈，Fisher公司；无水乙醇，天津北方化学试剂有限公司；磷酸，天津市华东试剂厂；冰醋酸，天津市标准科技有限公司；β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁，中国药品生物制品检定所(批号111689-200501)；异欧前胡素，中国药品生物制品检定所(批号110827- 200407)。

1.2　仪器与设备

HA220-50-06型超临界萃取装置，江苏南通市华安超临界萃取有限公司；Agilent 1200液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；LD1000-1电子天平，沈阳龙腾电子有限公司。

1.3　京万红超临界萃取工艺流程

用1 L萃取釜，在釜底垫脱脂棉且用纱布包裹铺平，将287 g京万红复方粗粉(过1号筛)与夹带剂拌匀装于釜中铺平，在萃取釜出口垫脱脂棉且用纱布包裹铺平后加萃取釜盖，拧紧后将萃取釜放于CO2超临界装置中。启动超临界装置后设定操作参数，达到提取温度后平衡30 min，分离温度比提取温度高5 ℃，启动CO2泵，升压待试验压力达到要求后，维持萃取条件20 min，继后打开分离釜阀门，维持萃取条件不变，每间隔10 min从分离釜中接收1次萃取物，称重，直至萃取物重量恒重时停止试验。

1.4　萃取工艺的均匀设计

1.5　验证试验

通过回归方程分析，得出最适宜的工艺条件，根据最适宜条件进行试验，重复3 次。

1.6　β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁的测定

1.6.1色谱条件[6]

Kromasil C184.6×250 mm，流速1 mL/min，流动相为乙腈-水-磷酸(600∶400∶5)，检测波长275 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL[6]。色谱图如图1～图3所示。

图1　β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品Fig.1　β,β-Dimethylacrylalkannin reference substance

图2　京万红超临界提取物Fig.2　SFE-CO2 extract of Jingwanhong

图3　β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁阴性京万红超临界提取物Fig.3　Blank control of β,β-dimethylacrylalkannin in SFE-CO2 extract of Jingwanhong

1.6.2供试品制备

向提取物中加300 mL无水乙醇，称重，超声溶解后至室温称重，补足失重，取5 mL于25 mL棕色容量瓶中，称重，加乙腈定容至刻度，摇匀，用0.45 μm有机滤膜过滤，收集滤液。

1.6.3标准曲线

配制6个不同浓度的β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁乙醇溶液，浓度分别为0.012 34、0.024 68、0.049 36、0.074 04、0.098 72和0.123 40 g/L，按1.6.1测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y=2×107X+14 589，R2=0.999 6。

1.6.4精密度

取新配制0.254 40 g/Lβ，β-二甲基丙烯酰阿卡宁乙醇溶液，连续进样5次，得RSD为1.95%。

1.6.5加样回收率

精密量取同一超临界提取物适量，共3份，分别加入1 g/Lβ,β-二甲基丙烯酰阿卡宁乙醇溶液制成供试品3份，按1.6.1测定含量，求得平均加样回收率97.58%。

1.7　异欧前胡素的测定

1.7.1色谱条件

Kromasil C184.6×250 mm，流动相为乙腈-1%冰醋酸(50：50)，流速1.5 mL/min，检测波长300 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。色谱图如图4～图6所示。

图4　异欧前胡素标准品Fig.4　Isoimperatorin reference substance

图5　京万红超临界提取物Fig.5　SFE-CO2 extract of Jingwanhong

图6　异欧前胡素阴性京万红超临界提取物Fig.6　Blank control of isoimperatorin in SFE-CO2 extract of Jingwanhong

1.7.2供试品制备

向提取物中加300 mL无水乙醇，称重，超声溶解后至室温称重、补足失重，取5 mL于25 mL棕色容量瓶中，称重，加乙腈定容至刻度，摇匀，用0.45 μm有机滤膜过滤，收集续滤液。

1.7.3标准曲线

新配制6个不同浓度异欧前胡素乙醇溶液分别为0.982 40、1.228 00、1.473 60、2.456 00、4.912 00和6.140 00 μg/mL，按1.7.1测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y=13.36X-2.146 1，R2=0.999 8。

1.7.4精密度

新配制0.245 60 μg/mL异欧前胡素乙醇溶液，连续进样5次，得RSD为1.05%。

1.7.5加样回收率

精密量取同一超临界提取物适量，共3份，分别加90 μg/mL异欧前胡素乙醇溶液，制成供试品3份，根据1.7.1中HPLC条件测定含量，求得加样回收率96.61%。

2　结果与分析

2.1　均匀设计对提取工艺的优化

以出膏率、β，β-二甲基丙烯酰阿卡宁含量和异欧前胡素含量为指标进行均匀设计。

均匀试验结果见表1，各因素显著性检验如表2，残差分析如表3所示。

加权值=Σ实测值/均值×权数×100

其中出膏率的权数为0.5，β,β-二甲基丙烯酰阿卡宁的权数为0.25，异欧前胡素的权数为0.25。如第6组：

Y=(10.7/12.6×0.5+0.961/1.020×0.25+
69.58/84.85×0.25)×100

通过Excel软件建立多元回归模型[8]，采用多项式逐步回归，获得回归方程：

第8组的预测Y值最大，残差较小，表明压力为25 MPa，温度为50 ℃，醇浓度为95%时，收膏率及指标成分含量各项指标为最优。

2.2　最适宜提取条件的验证

采用压力为25 MPa，温度为50 ℃，乙醇质量分数为95%，重复3批进行验证。结果如表4所示。

表均匀试验设计与结果Table Uniform experimental design and results

表2　各因素显著性检验Table 2　Significant inspection of various factors

表3　残差分析Table 3　Residual analysis

表4　最适宜工艺验证结果Table 4　Results of verifiction tests

结果显示，通过均匀设计优化超临界提取京万红，所得最适宜工艺结果重复性良好。

3　结论

超临界萃取法能够有效保留京万红中热敏有效成分，为京万红的二次开发提供了试验基础。

参考文献：

[1]李永平，赵士美，杨长林.京万红的基础研究及临床应用[J].中成药,1983，14(12):23-24

[2]张清英.京万红治疗糖尿病足[J].中国民间疗法，2008(6):14-14

[3]张朝晖,马静.京万红联合橡皮生肌膏治疗糖尿病足的疗效观察[J].中国全科医学:医生读者版,2010，(12):70-70

[4]莫少红.均匀设计法在中药制中的概况[J].时珍国医国药, 2001, 12(8):734-735

[5]方开泰.均匀设计与均匀设计表[M].北京:科学出版社, 1994

[6]赵华,游勇基.紫草药材化学成分的测定[J].海峡药学,2007,19(4):35-38

[7]王洪志,李惠芬,周静.HPLC法测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素[J].中草药,2007,38(7):1 018-1 019

[8]张一芳,耿绍.用电子表格Excel进行均匀设计的数据处理[J].数理医药学杂志，2008,21(5):534-535