华蟾素诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡与Bax/Bcl-2的关系

徐晓武，杨小敏，金洲祥，许 远，朱少俊

华蟾素诱导人乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡与Bax/Bcl-2的关系

徐晓武1，杨小敏2，金洲祥1，许 远1，朱少俊1

目的：观察华蟾素在诱导人乳腺癌MCF-7细胞株凋亡的过程中Bax和Bcl-2蛋白表达的变化及意义。方法：在人乳腺癌细胞株MCF-7中分别加入不同终浓度的华蟾素，24 h、48 h及72 h后检测指标。应用MTT比色法检测细胞增殖活力，倒置显微镜观察细胞形态学变化，TUNEL法检测细胞凋亡指数，Western blot法检测Bax/Bcl-2蛋白表达，共聚焦显微镜观察Bax蛋白分布。结果：华蟾素能显著抑制MCF-7细胞增殖；倒置显微镜下发现凋亡的MCF-7细胞固缩、核染色质凝聚；western blot发现华蟾素能上调MCF-7细胞Bax蛋白表达，但对Bcl-2蛋白表达无影响，正常MCF-7细胞内的Bax均匀分布于细胞质中，华蟾素处理后，Bax明显地聚集于线粒体，呈现线粒体的转位。结论：华蟾素诱导MCF-7细胞凋亡，并在该过程中导致的Bax蛋白表达上调并且向线粒体转位。

华蟾素注射液；人乳腺癌细胞株MCF-7；凋亡；Bax；Bcl-2

中药诱导肿瘤细胞凋亡是重要的抗肿瘤机制之一。华蟾素注射液是我国传统药材中华大蟾蜍阴干全皮加工制成的水溶性注射剂，主要成分是蟾毒灵及吲哚生物碱等，具有清热解毒、利水消肿、化瘀溃坚等作用[1]。本研究观察了华蟾素对体外培养的MCF-7细胞凋亡与Bax/Bcl-2蛋白表达的关系，并探讨了华蟾素抗肿瘤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材 料 华蟾素注射液（安徽金蟾生化股份有限公司，每支5 mL，批号041003）。兔抗Bax单克隆抗体、兔抗Bcl-2单克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（北京中杉金桥生物工程有限公司）。人乳腺癌MCF-7细胞株（上海微晶生物技术有限公司）。DMEM（GIBCO公司,美国）。MTT（Sigma公司）。FITC标记Bax抗体。（北京博奥森生物技术有限公司）。TUNEL检测试剂盒（上海生研生物技术公司）。高速冷冻离心机MR23i (法国Jouan)。荧光显微镜（Olympus,日本）。Leica TCS-SP2激光共聚焦扫描显微镜（LSCM，德国Leica公司）。

1.2 细胞培养 人乳腺细胞株MCF-7细胞常规复苏，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。在培养中，细胞被置于37℃、5%CO2、饱和湿度下的培养箱内。取对数生长期的细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，行细胞计数。调整细胞悬液浓度至1× 105个/mL。

1.3 检测细胞增殖抑制率 采用噻唑蓝还原法（MTT比色法）。将细胞以1×105/mL浓度接种于96孔板，每孔100 μL。24 h后加入华蟾素（终浓度分别为10、20及40 μg/mL），每个浓度重复5孔，独立重复6次。以不加药组为空白对照，在37℃、5% CO2的条件下培养孵育24 h、48 h及72 h，弃药液。每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，于完全培养基中培养4 h。每孔加入20%SDS 100 μL，在37℃下放置20 h，用酶标仪检测各孔570 nm波长的光密度（OD）值。肿瘤细胞增殖抑制率（%）=[(对照组OD值-用药组OD值)/对照组OD值]×100%。

1.4 细胞形态学观察 用40 μg/mL华蟾素作用细胞24 h、48 h及72 h，收集细胞，倒置显微镜观察、拍摄细胞形态变化。

1.5 检测Bax和Bcl-2蛋白表达 胰酶消化并收集经40 μg/mL华蟾素作用24 h、48 h及72 h的MCF-7细胞，细胞裂解液裂解细胞，Bradford法测定蛋白浓度。取总蛋白20 μg加样，经15%SDS-PAGE电泳，电转移半干转法将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。含5%脱脂奶粉PBS溶液封闭，4℃孵育过夜。次日复温1 h，弃去牛奶，孵育1抗3 h，PBS洗膜3次，每次15 min。孵育2抗1.5 h，PBS洗膜3次，每次15 min。荧光试剂盒显影曝光。采用Quantity One软件进行图像灰度分析，计算Bax和Bcl-2与β-actin的灰度比值，以表示Bax和Bcl-2的相对表达量，不加华蟾素组做对照。

1.6 检测细胞凋亡 胰酶消化并收集细胞，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法，按TUNEL检测试剂盒推荐步骤操作，荧光显微镜下观察。细胞浆出现黄绿色荧光信号确定为凋亡细胞，计算细胞凋亡指数（apoptotic index,AI＝染色阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%）。

1.7 检测Bax蛋白 收集经40 μg/mL华蟾素作用72 h的MCF-7细胞，加入适当浓度的线粒体荧光染料Mito Tracker Red，于37℃孵育25 min，冷PBS清洗，在40 g/L多聚甲醛中室温固定15 min，并用2 mL/L Triton X-100透化处理5 min。以PBS充分清洗，加100 mL/L羊血清封闭1 h，依次加入兔抗Bax抗体（4℃孵育过夜，PBS充分清洗）及FITC标记的抗兔IgG（避光孵育30 min），激光共聚焦显微镜下观察结果并拍照。

2结果

2.1 华詹素对细胞增殖抑制的影响 各浓度华蟾素均能显著抑制细胞增殖，在实验浓度范围内抑制率随药物浓度增加呈上升，40 μg/mL的华蟾素作用72 h引起的生长抑制率达56.31%。部分组间呈现时-效和量-效依赖关系（P＜0.05）。见表1。

2.2 细胞形态学变化 倒置显微镜观察发现正常的MCF-7细胞成团大量生长，细胞圆润饱满，细胞形态良好。40 μg/mL华蟾素处理后，细胞数目减少，细胞固缩变形，体积变小。见图1。

表1 不同浓度华蟾素对MCF-7细胞的增殖抑制作用(±s，n=15)

表1 不同浓度华蟾素对MCF-7细胞的增殖抑制作用(±s，n=15)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与10 μg/mL组比较，bP＜0.05；与20 μg/mL组比较，cP＜0.05；与24 h组比较，dP＜0.05

浓度(μg/mL)对照组（0）10 20 40增殖抑制率（%）24 h 0 13.62±2.82 18.47±3.55 24.27±3.55a48 h 0 17.52±2.53 29.16±3.62a40.83±3.57a、b、c 72 h 0 24.25±2.89a41.67±4.37a、b、d 56.31±4.81a、b、c、d

图1 倒置显微镜下观察细胞形态（×200）

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡率 与对照组相比，华蟾素处理组绿色荧光的凋亡细胞核增高，且随着时间的延长，凋亡细胞逐渐增加。见图2。不同浓度组之间比较，增殖抑制率差异有显著性，部分组间呈现时-效和量-效依赖关系（P＜0.05）。见表2。

图2MCF-7细胞TUNEL染色法（×200）

2.4 western blot检测Bax/Bcl-2蛋白表达 Western blotting结果经灰度值分析后显示，随着华蟾素作用时间的延长，MCF-7细胞中Bax蛋白表达逐渐上调，呈现时-效依赖关系（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。见图3、表3。

表2 不同浓度华蟾素对MCF-7细胞凋亡率的影响(±s，n=15)

表2 不同浓度华蟾素对MCF-7细胞凋亡率的影响(±s，n=15)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与10 μg/mL组比较，bP＜0.05；与20 μg/mL组比较，cP＜0.05；与24 h组比较，dP＜0.05

浓度(μg/mL)对照组10 20 40细胞凋亡率（%）24 h 10.24±1.61 11.35±2.33 12.24±3.15 16.37±2.18a48 h 10.24±1.61 13.52±2.29 18.16±3.52a30.73±3.46a、b、c、d 72 h 10.24±1.61 16.25±2.53 26.67±4.71a、b 51.42±4.27a、b、c、d

图3 40 μg/mL华詹素对MCF-7细胞表达Bcl-2和Bax蛋白的影响

表3 40 μg/mL华蟾素对MCF-7细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响(±s，n=15)

表3 40 μg/mL华蟾素对MCF-7细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响(±s，n=15)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与24 h组比较，bP＜0.05；与48 h组比较，cP＜0.05

Time(h)对照组24 48 72 Bcl-2 0.43±0.022 0.42±0.021 0.40±0.019 0.37±0.016 Bax 0.47±0.025 0.51±0.029 0.62±0.033a0.75±0.036a、b、c

2.5 Bax蛋白细胞荧光免疫检测 正常MCF-7细胞内的Bax均匀分布于细胞质中，华蟾素处理后，Bax明显聚集于线粒体上，呈现明显的线粒体的转位。见图4。

图4 40 μg/mL华詹素处理MCF-7细胞72 h后Bax蛋白线粒体转位

3 讨论

肿瘤的发生与增殖、凋亡与分化三者的平衡失调而导致的细胞过度生长增殖和凋亡受阻有关，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的药物,将在肿瘤的治疗中发挥重要作用。本研究采用MTT法检测，发现华蟾素能抑制MCF-7细胞增殖，且呈明显的量—效与时—效关系。利用倒置显微镜观察MCF-7细胞与华蟾素作用后的形态学变化，发现凋亡的MCF-7细胞固缩、核染色质凝聚，这种变化随着华蟾素浓度的上升和作用时间的延长而变得显著。

凋亡是细胞在基因调控下的主动死亡形式，调控凋亡的基因可分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因两类。Bcl-2基因属于Bcl-2家族基因，是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，与肿瘤的发生和进展密切相关。Bax是Bcl-2家族中重要的诱导细胞凋亡的基因，其编码蛋白氨基酸序列有21%与Bcl-2同源，Bax可与Bcl-2形成同源或异源二聚体，具有抑制Bcl-2，促进细胞凋亡的作用。Bcl-2与Bax两者之间的比例决定了细胞的命运，若Bax占多数，则Bcl-2被抑制，凋亡被诱导，细胞死亡；反之则Bax受到抑制，细胞得以生存[2]。Bax不但拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用[3-4]，而且能够直接促进细胞凋亡。Western blotting结果经灰度值分析后显示，华蟾素能上调MCF-7细胞中Bax蛋白表达，呈现时-效依赖关系（P＜0.05），而对Bcl-2蛋白表达无显著性差异（P＞0.05）。在正常细胞生理状态下，Bax主要分布在胞质，在凋亡刺激因子的作用下，则从细胞胞质转位到线粒体，并在线粒体外膜形成孔径较大的通道，导致线粒体膜电位的丢失及线粒体内促凋亡分子（如细胞色素C等）的外流，进而启动细胞凋亡过程[5]，最终激活caspase-3引起细胞凋亡[6-7]。本研究发现，正常的MCF-7细胞内的Bax均匀分布于细胞质中，华蟾素处理后，Bax明显聚集于线粒体上，呈现明显的线粒体的转位。表明华蟾素诱导MCF-7细胞凋亡的过程中，伴有Bax蛋白表达上调及Bax蛋白线粒体转位。综上所述，华蟾素在一定剂量范围内抑制MCF-7细胞增殖，诱导其凋亡。其可能的作用机制在分子水平上，表现为对凋亡相关基因Bax的有效调控，提示华蟾素在乳腺癌中具有潜在的应用价值。

[1]Qi FH,Li AY,Zhao L,et al.Cinobufotalin,an aqueous extract from Bufo gargarizans Cantor,induces apoptosis through a mito⁃chondria-mediated pathway in human hepatocellular carcinoma cells[J].J Ethnopharmacol,2010,3(128):654-661.

[2]Rui D,Xiaoyan C,Taixiang W,et al.Elemene for the treatment of lung cancer[J].Cochrane Database SystRev,2007,17(4): CD006054.

[3]Cory S,Adams JM.Killing cancer cells by flipping the bcl-2/bax switch[J].Cancer Cell,2005,8(1):5-6.

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[5]Kukreja RC,Xi L.eNOS phosphorylation:a pivotal molecular switch in vasodilation and cardioprotection[J]?J Mol Ce ll Cardi⁃ol,2007,42(2):280-282.

[6]Bajt ML,Farhood A,Lemasters JJ,et al.Mitochondrial bax translo⁃cation accelerates DNA fragmentation and cell necrosis in a mu⁃rine model of acetaminophen hepatotoxicity[J].J Pharmacol Exp Ther,2007,324(1):8-14.

[7]Tikhomirov O,Carpenter G.Bax activation and translocation to mi⁃tochondria mediate EGF-induced programmed cell death[J].J Cell Sci,2005,118(Pt24):5681-5690.

（收稿：2012-06-10 修回：2012-10-28）

（责任编辑 王 丰）

Relationship between Bax/Bcl-2 and Cinobufotalin Injection-induced Human Breast Cancer Cell Lines MCF-7 apoptosis

XU Xiao-wu,YANG Xiao-min,JIN Zhou-Xiang,et al. The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou（325027）,China

Objective To explore the changes of Bax/Bcl-2 in Cinobufotalin induced apoptosis in human breast cancer cell line MCF-7. Methods Human breast cancer cell line MCF-7 was exposed to Cinobufotal⁃in in different concentrations respectively.Each concentration group was exposed for 24 h,48 h and 72 h.MTT assay was performed to detect the proliferation of the cells.The morphological changes of the cells were ob⁃served with the aid of inverted microscope.Apoptosis index was determined by Terminal deoxynucleotidyl trans⁃ferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)assay.Western blot analysis was used to test Bax/Bcl-2 expression.Bax distribution was assessed by immunofluorescence staining. Results Cinobufotalin inhibited the proliferation of MCF-7 cells.The percentage of apoptotic cells treated with Cinobufotalin increased as com⁃pared to untreated cells.Western blotting revealed up-regulation of the Bax protein.However,Cinobufotalin did not affect expression of the Bcl-2 protein.Bax was evenly distributed in cytoplasm in normal MCF-7 cells,In constrast,Bax was translocated from cyto⁃plasm to mitochondria after Cinobufotalin treatment. Conclusions Cinobufotalin-induced apoptosis in MCF-7 cells was accompanied with an up-expression of Bax protein and a mitochondrial translocation of the protein.

Cinobufotalin injection；human breast cancer cell lines；apoptosis；bax；Bcl-2

Q95-33；R737.9

A

1007-6948(2012)06-0580-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.06.013

1.温州医学院附属第二医院肿瘤外科（温州 325027）

2.温州市第三人民医院病理科（温州 325000）

杨小敏，E-mail：yxm19780325@163.com