影响家畜人工授精诱导子宫免疫反应的因素的研究进展

李井春，李雁冰，张乃博，刘胜军，曲永利，贺显晶，孙蕊，舟桥弘晃

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物繁殖实验室，大庆163319；2.山东大学生命科学学院；3.日本冈山大学自然科学研究科）

人工授精技术是目前家畜改良的重要技术手段之一。通常，如猪每次人工授精输入1～5亿个精子，最终只有几百个精子能够到达受精部位[1]。然而，注入的大部分精子从母畜生殖道通过回流和被子宫内的白血球所吞噬而损失。如果这些损失可以通过某种方法去控制，我们将可以减少人工授精时精子数量来提高改良的效率。目前，关于影响家畜人工授精诱导子宫炎症反应因素的论文还未见报道，主要从动物繁殖免疫学的角度分析，母畜生殖道人工授精前后的免疫细胞的分布情况、精子在子宫内损失的原因、人工授精精液稀释液成分对子宫免疫反应的影响以及控制由人工授精诱导的子宫免疫反应的措施等方面做一系统的综述。

1 母畜生殖道内免疫细胞随发情周期的变化的分布情况

1.1 未配种母畜在发情周期的不同阶段子宫内膜中白细胞的形态和分布

母畜生殖道的子宫内膜随性腺激素水平的变化而做相应变化。有研究已经证实随着这些激素的改变，雌性生殖道上皮形态和白细胞的分布也发生变化[2-3]。子宫上皮是由表面上皮细胞和腺上皮细胞组成。间情期时在孕激素的影响下，表面上皮细胞是呈立方型和低柱状[4]。在间情期中期，腺上皮细胞分泌活动达到高峰。向发情期过渡时，以雌激素为主，目前有研究表明主要是子宫重量和子宫内膜厚度增加[5]。以上变化主要是为满足交配要求子宫而作的准备。

1.2 母畜生殖道内免疫细胞类型和分布

在子宫内膜中发现的免疫细胞的类型主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞（polymorphonuclear leucocytes，PMNs）、嗜酸性粒细胞等[3]。大多数细胞在任何时间都能够发现，但它们的数量随发情周期不同而发生变化[6]。

在母畜生殖道内，参加自然免疫反应的白细胞主要有嗜中性粒细胞和巨噬细胞两种，主要聚集在子宫内膜和子宫颈基质膜中，在发情前期，它们会穿过子宫内膜进入到子宫腔或子宫颈腔[7]。发情期时，如母羊生殖道内的嗜中性粒细胞和巨噬细胞显著增加，其中嗜中性粒细胞在发情后24 h时达到峰值，巨噬细胞在18 h到达峰值，随后开始下降到发情前期的水平；此外，母牛的生殖道内的白细胞大约95%是嗜中性粒细胞，并且在子宫颈和子宫内膜基质中的分布与交配后的母牛相似[8]。

母畜生殖道内的白细胞的类型和分布主要受激素水平的影响。在发情前期大量的白细胞分布在内膜基质中，当进入发情期或有交配行为时，白细胞迅速地迁移到子宫颈或子宫腔内，参与子宫的免疫反应。一些研究者证实自然交配或人工授精都可以诱导子宫短暂的炎症反应。对于配种后炎症反应，主要由嗜中性粒细胞参与完成[9-10]。

2 人工授精的精液稀释液成分对子宫炎症反应的影响

人们研究发现自然交配或人工授精后，大量的嗜中性粒细胞迅速迁移到子宫腔[9]。如人工授精后母猪生殖道内的精子数量在数小时内下降到输入精子总数的5%～10%[11]。但是，免疫细胞趋化和吞噬精子可考虑作为正常生理反应，可能为胚胎在子宫内着床做必要的准备。然而，目前还不清楚是什么原因引起的白细胞迁入到子宫腔内，以及来如何控制嗜中性粒细胞的趋化和吞噬作用。此外，精液成分对子宫免疫状态和妊娠的建立的影响也不清楚。

2.1 精浆对PMNs的趋化性和吞噬性的影响

有研究表明家畜的精浆可以调节PMNs的趋化和对精子的吞噬活性[12]。有研究显示精子可能通过某些成分诱导PMNs的趋化。例如使用稀释的精液进行人工受精后，子宫腔内的PMNs显著增加，但当0.1%精浆存在时，子宫腔内的PMNs数量明显减少[13]。然而，也有报道称配种后猪精浆诱导子宫的炎症反应[24]。Alghamdi等人实验结果表明马的精浆能够显著减少PMNs对精子的吞噬作用[14]。此外，来源于马精浆蛋白也明显抑制PMNs对精子的吞噬，体外实验结果显示马的精浆同样明显抑制PMNs的趋化性、吞噬性和补体的活性[9]。

有研究证实了精浆能够抑制PMNs对精子的趋化和吞噬活性，从而使子宫腔内的具有活力的精子数增加。李井春等人的体外实验结果表明家畜精浆能够抑制PMNs对精子的趋化和吞噬活性[15-16]。

2.2 精液稀释液成分（卵黄）对PMNs的趋化性和吞噬性的影响

有研究报道称母猪子宫内的PMNs是由于人工授精时输入一定体积的液体量、而不是由于液体中的某些成分或精浆触发PMNs向子宫腔剧增[9]。然而，人工授精12 h后，还有大量的PMNs存在于子宫腔内，主要可能原因与精子的存在有关[10]。Matthijs等人的研究结果证实损伤、死的或过获能精子并没有完全被吞噬掉，但是精子获能处理能够明显降低精子被吞噬的数量。

此外，鸡的卵黄是一种有效防止精子冷休克和保护精子功能及受精能力的稀释液和冷冻保护剂。近来，卵黄被证实与牛精浆对PMNs吞噬作用抑制作用相反[17]。此外，在狗的人工授精中，含有卵黄稀释液的精液人工授精后有可能诱导子宫内炎症反应[18]。李井春等研究结果也证实在体外卵黄增强PMNs的趋化性[19]。

3 精子在子宫内的选择

3.1 精子的损失

猪人工授精后很短一段时间（数分钟至数小时）内发生精液逆流，一次损失的精子数量达输入精液的45%左右[10-11]。大量的精子通过阴道逆流而损失主要依赖于人工授精时的精液体积和母猪的状态变化而变化。精液逆流被认为是一种正常的生理现象，这种现象存在于每头母猪，只要输入的精子数量不是很低，损失的数量一般对受胎率有不良的影响。精液逆流现象的存在，它可能是与子宫的大小有关，有实验结果表明初产猪要比经产猪的逆流体积要大。

3.2 子宫内精子的选择

大量的研究结果证实人工授精诱导大量的PMNs迁移到子宫腔，并吞噬精子[9-10，17]。通常，PMNs的吞噬作用去除了子宫内输入的大量过剩精子和细菌，通过这种清除作用，为即将附植的胚胎做好准备[1]。但是，没有数据证明损伤的、老化的及死亡的精子成为PMNs吞噬的对象，李井春等人研究结果表明在体外实验中PMNs不管精子的死、活的吞噬率没有显著的差异[16]，这种吞噬仅仅对子宫内的精子起作用，而在输卵管中几乎没有PMNs的存在。大多数的研究结果证实了人工授精后输入的精子数量在很短时间内迅速减少，起初是通过阴道精液逆流作用起主要作用，随后PMNs吞噬精子成为精子损失的主要途径之一。经过子宫内的选择，仅有少量的有活力且具有受精能力的精子才能到达输卵管壶腹部，而且数量小于102个。

4 控制免疫细胞对精子的趋化和吞噬作用的技术措施

以上精子损失的原因的分析，通过PMNs吞噬精子方式将精子从子宫内清除是一种正常的并且必要的过程。在某种程度上抑制或延迟PMNs的剧增和吞噬精子也成为研究的焦点，以至于使用少量的精子成功地完成受孕的过程。

4.1 改良精液稀释液

近来，为了使用少量的精子人工授精维持较高的妊娠率，使精子在雌性生殖道内损失量达到最小化。尽管PMNs吞噬活性的调控可能使精子的损失，精浆成分对PMN的吞噬性影响的研究在许多家畜上得到证实，目前根本的机理还不清楚，有待进一步研究。

有研究报道调节猪的PMNs吞噬性的研究。新鲜的血浆中含有活性补体成分，可以通过调理靶细胞来刺激PMNs的活性，尽管血浆也可诱导精子头与头的凝集，特别是对于具有完整质膜的精子[20]。

用仅含有磷酸二脂酶抑制剂——咖啡因或与钙离子一起混合的培养液预处理精子使精子获能，明显减少PMNs对精子的吞噬[10]。尽管获能物质，如咖啡因，肝素激活精子并减少精子数量级数，它可能增加PMN对精子的吞噬性。在体外吞噬实验模式中PMN吞噬活性通过添加咖啡因和氯化钙被降低[10]。此外，山口等实验结果显示使用添加咖啡因和氯化钙的猪的冷冻精液人工授精能够明显降低PMNs对精子的吞噬率并提高猪的受胎率[23]。李井春等也同样证明了咖啡因明显降低PMNs对精子的趋化性和吞噬性[15-16]。

此外，肝素是一种粘多糖，通常作为抗凝血剂而使用以及用于牛的刺激精子获能[21]。另外，肝素也抑制兔PMNs对细菌的吞噬性。有报道称在体外实验中，肝素抑制猪、牛PMNs对精子的趋化性和吞噬性[15]。

4.2 改良人工授精方法：子宫角深部输精方法

最近几年，猪的输精技术得到发展和改良[22]。使精子能输到更深的部位——子宫角。子宫角深部输精方法已经在猪上得到应用，这种技术应用低数量精子进行人工授精，取得与常规相似的结果。这种技术的基础是以很小的体积将精子放到接近受精的部位，这样就避免了精子在子宫腔中的运行，这样就减少了精子在子宫内的损失，同时也避免了精液的逆流。

无论在人工授精的精液中添加一些免疫抑制物，还是使用新的人工输精方法，其主要的目的是减少PMNs向子宫腔内的迁移和降低PMNs对精子的吞噬性来提高人工授精的受孕率。

5 展望

配种后子宫炎症反应是一个复杂的、难懂的过程。人工授精诱导家畜子宫内的炎症反应机理以及精子在子宫内的损失机制的研究较少，精液中的哪种成分诱导嗜中性粒细胞趋化、PMNs如何吞噬精子以及通过什么方式抑制PMNs的趋化和吞噬作用等问题，仍然是今后研究工作的重要课题。家畜子宫免疫反应机理的研究，一方面可以为家畜繁殖免疫学的发展积累资料，另一方面为家畜人工授精技术的发展提供帮助，特别是为低剂量精子人工授精技术的开发提供新的途径。

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