细胞凋亡与线粒体自噬在间歇低氧神经损伤中的应用

禹江涛 王红阳 韩广超 王 袁 张丽丽

(河北联合大学附属医院呼吸内科 河北唐山 063000)

细胞凋亡是在基因严格控制下主动的细胞“自杀”行为，又称为细胞程序性死亡。细胞通过信号传导引起某些基因转录和翻译发生改变，引起细胞器缩小而不裂解，染色体DNA断裂，形成凋亡小体最终被巨噬细胞识别并吞噬。近年来有文献报道，睡眠呼吸暂停导致神经损伤从而影响认识功能［1］。同时研究表明，慢性间歇低氧可诱导神经细胞凋亡引起神经系统损伤［2～4］。我们前期动物实验已证实慢性间歇低氧条件下神经细胞出现凋亡［2，5］。细胞凋亡有复杂的调控过程，包括信号转导系统、基因激活与转录、酶系统等。

1 细胞凋亡与间歇低氧神经损伤

间歇低氧引起细胞凋亡的机制尚不完全清楚，目前已知调控细胞凋亡的信号转导通路有:内质网相关性死亡(ERAD)通路、线粒体通路及死亡受体通路。其中ERAD途径:包含内质网应激诱导转录C/EBP的同源蛋白、JNK的活化和caspase－12蛋白水解酶的活化。当内质网发生应激时，位于内质网的caspase－12酶活性升高并活化，从内质网转运到胞浆，最终激活caspase－3等，最后引发细胞凋亡。线粒体通路:线粒体相关的主要凋亡蛋白有:CytC、BCL－2家族蛋白、凋亡蛋白酶激活因子－1(Apaf－1)以及凋亡诱导因子(AIF)等。BCL－2家族蛋白通过对线粒体通透性转换孔PTP进行调节，最终引起CytC的释放，诱导caspase水解导致细胞凋亡。而线粒体内的凋亡蛋白，如AIF等，进入细胞质后作用于细胞核，引起染色体凝集，引起凋亡［6］。死亡受体通路:死亡受体是细胞上的一类跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNFR)受体基因超家族，目前已知的死亡受体(TNFR －1、Fas、DR3、DR4、DR5)在细胞外均由一段含半胱氨酸的区域，配体与之结合后诱发细胞内侧具有蛋白质水解功能的“死亡区域”发生改变，传递凋亡信号，最终诱导细胞凋亡。有研究表明神经细胞损伤与间歇低氧后产生氧化应激有关［7］，这与Row B W等［8］研究CIH导致学习记忆损伤中发现大鼠体内氧化应激水平比正常对照组高的结果一致。总之，间歇低氧可以引起神经细胞凋亡，从而导致认知、学习及记忆功能障碍，但确切机制尚不明确，有待进一步研究。

2 线粒体自噬与间歇低氧信号转导途径

ERK:细胞外信号调节激酶(Extracelluar signal－regulated kinase)是真核生物细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是生物体内最重要的信号通路之一，由国外学者从哺乳动物细胞研究并最早发现的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员。主要包括两种异构体 ERK1和 ERK2(分别为 p44MAPK和p42MAPK)，二者与同源性高，一般统称为ERK1/2。ERK信号转导通路存在于大多数细胞中，ERK通路被激活后，作用于细胞浆或细胞核的底物，引起相关蛋白的特异性表达，调控细胞的应激、分化、增殖和凋亡等［9］。在脑缺血研究发现，ERK通路的激活介导细胞死亡［10］，与既往研究 ERK通路抑制神经细胞死亡［11］相比较，ERK通路在神经细胞的存活与凋亡过程中起着双重角色。

低氧条件下，目前研究表明HIF－1的活性表达受REK的直接修饰调节，同时REK对HIF－1蛋白的修饰不影响其稳定性及DNA结合能力，但抑制胞外信号调节激酶(ERK)的活性后HIF－1的转录活性也被抑制［12］。Sodhi的研究表明，应用ERK抑制剂(PD98059)及保留部分功能的Ras蛋白突变异构体等试验中证明REK通路信号传导活化并修饰HIF－1蛋白［13］。其中ERK1/2转位到细胞核内是信号传递的关键，且在早期有活性，长期慢性刺激HIF－1的反式激活功能不能活化。

细胞为了适应不同氧气浓度形成了完整的信号传导及调控机制。其中低氧诱导因子(HIF)广泛存在于人体及哺乳动物的一种转录因子。HIF由HIF－1α和HIF－1β两个亚基组成，在低氧条件下激活多种基因的转录来适应低氧环境。研究［14］表明HIF－1β不受氧浓度影响，而HIF－1和HIF－1α受氧浓度调节，HIF－1α是活性调节亚基，正常条件下HIF－1α的表达和降解处于动态平衡状态。低氧条件下，HIF－1α的降解受到抑制，从而积聚。HIF－1β存在于胞浆和胞核，其与HIF－1α进入胞核后与HIF－1β形成HIF－1异二聚体，HIF－1与低氧反应元件(HRE)结合并调控下游基因。目前已知受HIF－1调控的众多下游基因不但参与细胞的增殖分化、而且参与细胞代谢及细胞死亡等多种病理生理过程。其中受HIF－1直接调控的细胞死亡相关蛋白有BNIP3和BNIP3L(BNIP3－like)，均为Bcl－2中只含BH3结构域亚家族中的成员。他们的启动子中均含有HRE，并在低氧条件下诱导表达。与既往认为 BNIP3和BNIP3L是促凋亡蛋白不同，最近一些研究表明:HIF－1依赖性的BNIP3表达在大鼠心脏细胞线粒体自噬是不可或缺的［15］;Bellot等［16］证实，当正常细胞或癌细胞在低氧条件下发生线粒体自噬现象防止细胞死亡，而线粒体自噬通过HIF－1介导BNIP3和BNIP3L表达而发生。Zhang等［17］研究发现在低氧条件下线粒体发生自噬现象，其中低氧诱导因子HIF－1诱导的BNIP3表达起着至关重要作用。众所周知哺乳动物的正常红细胞内无线粒体，因为网织红细胞向成熟红细胞转化过程中，细胞内线粒体通过自噬而消失［18］。且相关研究［19］表明，线粒体自噬与其外膜上的BNIP3L(类BNIP3蛋白)相关，BNIP3L缺失的小鼠红细胞仍有线粒体存在。其中Beclin－1与Atg5的表达也参与了自噬过程。Beclin－1是一种与BNIP3和BNIP3L具有相同BH3结构域的蛋白质，被认为在调控自噬体的形成中有重要作用。低氧条件下，BNIP3和BNIP3L表达增多，Beclin－1被竞争性的从与Bcl－2或者Bcl－XL的复合物中游离出来形成PI3K复合体(Ⅲ型磷脂酰肌醇 －3－激酶复合体)，并通过PI3K/Akt途径激活线粒体自噬的发生［20］，Atg5是此调节途径的关键蛋白，起重要的介导作用。研究表明，长期低氧条件下，转录因子PERK被激活，诱导Atg5的表达，进而发生自噬;目前LC3检测自噬特异性高，当自噬现象发生时，LC3形成LC3－Ⅱ，且研究表明LC3－Ⅱ与细胞内自噬泡成正比。且免疫组化检测LC3B－Ⅱ与电镜观察自噬现象结果一致程度高，可作为检测自噬现象的重要指标［21］。同时外源性H2O2同样能导致线粒体损伤并激活自噬［22］。

3 细胞凋亡与线粒体自噬的关系

线粒体自噬是近年来被发现的一种在低氧状态下保障细胞氧化还原稳态的重要调控途径［23］。细胞在间歇低氧条件下发生代谢改变，线粒体通过降解蛋白质及损伤的细胞器来防止凋亡途径的触发，从而保护细胞。另外，在长期或剧烈应激条件下，持续的线粒体自噬导致细胞凋亡。因此，线粒体自噬在细胞的存活及死亡中起到重要的调节作用。线粒体通过氧化磷酸化产生ATP的同时，还生成活性氧(ROS)，包括:O2－、H2O2等。机体产生的ROS主要由线粒体代谢过程产生［24］，低氧条件下通过以下途径参与脑组织损伤:①损伤线粒体膜，线粒体释放CytC、凋亡诱导因子(AIF)等凋亡相关蛋白进入细胞质，诱导caspase水解，诱导细胞凋亡。②ROS攻击DNA，发生氧化反应，导致嘌呤、嘧啶氧化损害，引起DNA的断裂，导致信号传导中断。③通过上调核因子－κB(NF－κB)的表达，使环氧化酶2、iNOS及多种炎症因子如TNF－α及IL－8等表达增高［25］。机体处于间歇低氧条件下，机体的抗氧化平衡状态被打破，损害脂质、蛋白质、DNA等的生理功能，引起细胞损伤甚至导致细胞凋亡。而线粒体自噬可清除受损的线粒体减少ROS的产生，维持细胞内环境稳定，促进细胞存活。

4 小结

目前研究较多的是氧化应激、炎症反应及持续低氧诱导线粒体自噬的相关机制，对于慢性间歇低氧条件下线粒体自噬研究报道较少。睡眠呼吸暂停低通气综合征是一种病因复杂且病理机制尚不完全明确的疾病，OSAS造成慢性间歇低氧，使机体处于应激状态，诱导脂质、蛋白及DNA损伤，从而造成细胞损伤甚至死亡。间歇低氧应激状态下，机体的信号转导通路被激活，活化相关基因转录，促进细胞修复。线粒体是细胞代谢及能量产生的重要场所，对细胞的存活起到至关重要作用，当机体受到间歇低氧应激时，线粒体自噬通过降解受损的线粒体来适应低氧环境以维持细胞内动态平衡，防止进一步损伤。然而线粒体自噬是把双刃剑，在慢性间歇低氧早期，通过降解损伤的线粒体对细胞存活具有重要意义，但长期慢性间歇低氧可能导致线粒体过度自噬诱导细胞凋亡。但与其他间歇低氧相关信号转导通路如:P38、JNK等之间有无相互作用还待进一步研究。线粒体自噬导致细胞凋亡途径可能是造成OSAS患者学习、认知等功能障碍的病理机制之一，尽管间歇低氧条件下线粒体自噬机制并不完全明确，但是仍为OSAS的进一步研究提供新的方向。

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